刘彩虹 陈志强

1.河北省承德市妇幼保健院病理科，河北承德067000，2.河北省承德市中心医院泌尿外科，河北承德067000

子宫内膜不典型增生患者内膜组织中错配修复蛋白的表达情况

刘彩虹1陈志强2

1.河北省承德市妇幼保健院病理科，河北承德067000，2.河北省承德市中心医院泌尿外科，河北承德067000

目的探讨子宫内膜不典型增生患者子宫内膜组织中错配修复（MMR）蛋白的表达情况及微卫星序列的不稳定性（MSI）。方法选取承德市中心医院2005年10月～2015年6月存档的200例患者的子宫内膜增生组织为研究对象，按增生类型分为单纯性增生组（n=50）、复杂性增生组（n=50）、单纯性非典型增生组（n=50）及复杂性非典型增生组（n=50）四组，采用免疫组织化学法检测四组内膜组织中MMR蛋白（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）的表达情况，比较四组的MMR失表达率，观察非典型增生患者的MSI［低度微卫星不稳定（MSI-L）、高度微卫星不稳定（MSI-H）］和MSS表型与年龄的关系。结果复杂性非典型增生组的MLH1、MSH2、PMS2及MSH6的失表达率高于其他三组，且单纯性非典型增生组、复杂性增生组、单纯性增生组的MMR失表达率逐渐降低，四组患者的MLH1、MSH2、PMS2失表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），但四组MSH6失表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；MSI-H、MSI-L和MSS表型在单纯性增生组、复杂性增生组、单纯性非典型增生组及复杂性非典型增生组中的表型比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在单纯性非典型增生组和复杂性非典型增生组中，MSI-H、MSI-L及MSS表型在年龄≤50岁和＞50岁患者间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论MMR蛋白的失表达及微卫星不稳定性可能是子宫内膜不典型增生患者的重要分子事件。

子宫内膜不典型增生；错配修复蛋白；微卫星不稳定性；免疫组织化学

子宫内膜增生（Endometsial hyperplasia，EH）是妇女的常见病、多发病。其中子宫内膜不典型增生是子宫内膜癌的一种癌前病变［1］，子宫内膜癌的发病通常经历复杂型增生、不典型增生到癌的发展过程。DNA错配修复（Mismatch repair，MMR）系统由一系列酶分子组成，主要包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6等，能够特异性识别并纠正DNA复制时出现的错配碱基，对避免基因变异，保持基因在人体细胞中的稳定性和完整性具有极为关键的作用［2］。若MMR基因功能出现缺陷，细胞的修复错配功能下降则会导致遗传信息传递错误从而引发肿瘤［3］。有研究表明［4］，微卫星序列不稳定性（Micro satellite instability，MSI）作为一种肿瘤形成机制，是MMR出现缺陷的细胞因纠正错误碱基的能力下降从而引起的复制错误。目前，国内外关于子宫内膜非典型增生患者中MMR蛋白的表达变化的研究甚少。本研究探讨了子宫内膜不典型增生患者中MMR蛋白的表达情况，明确MSI的存在与否，旨在提高对子宫内膜增生的认识和防治，为子宫内膜非典型增生和子宫内膜样型子宫内膜癌的预防和早期诊断提供有效途径，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取承德市中心医院2005年10月～2015年6月存档的子宫内膜增生患者的病理切片，由两位资深病理医师复审，严格按照WHO诊断标准，选取200例符合条件者进入研究。按增生类型分为单纯性增生组（n=50）、复杂性增生组（n=50）、单纯性非典型增生组（n=50）及复杂性非典型增生组（n=50）四组，其中单纯性增生组年龄26～72岁，平均（42.2±1.4）岁；复杂性增生组年龄24～73岁，平均（43.5±1.2）岁；单纯性非典型增生组年龄28～72岁，平均（45.5±1.6）岁；复杂性非典型增生组年龄29～74岁，平均（46.2±2.1）岁。四组患者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 子宫内膜增生类型诊断标准

①单纯性增生：腺体数目增多，轻度拥挤，但未达到背靠背拥挤的程度；腺体大小不一，部分腺腔扩张，形成不小不等的囊性变；无细胞的非典型改变。②复杂性增生：增生腺体外形不规则，腺体密集、拥挤、背靠背，结构明显复杂，无细胞的非典型改变。③单纯性非典型增生：单纯性增生的病变伴有细胞的非典型性。④复杂性非典型增生：复杂拥挤的腺体伴有细胞的非典型性。

1.3 检测方法

采用免疫组化En Vision法对MMR蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的表达进行检测。试剂包括：单克隆鼠源性抗体MSH6（1∶200）、MSH2（1∶100）、PMS2（1∶40）、MLH1（1∶80）、EnVision免疫组化二步法试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色剂，均购自北京中杉桥生物公司。方法：把选取的石蜡标本切成厚4 μm的连续切片，常规脱蜡、水化后，采用煮沸热修复法修复抗原，将pH 6.0的浓度为0.01 mol/L的枸缘酸钠缓冲溶液在水浴锅中加热至95℃左右，放入切片加热10 min后用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液冲洗切片，放入3% H2O2溶液10 min。洗涤后加入一抗，37℃下孵育60 min，再用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液冲洗后加入二抗，37℃下孵育40 min，洗涤后DAB控制显色。冲洗、苏木精复染、脱水、封片。阳性对照采用已知的阳性片，阴性对照采用磷酸盐缓冲液代替一抗。

1.4 观察指标

观察指标包括MMR蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的表达情况及微卫星序列的不稳定性。其中MMR蛋白正常表达在细胞质和细胞核均可着色。每个切片均于400倍镜下选择10个视野，统计阳性细胞数，阳性细胞数小于10%为阴性标本，大于或等于10%为阳性标本。阳性细胞判断标准：细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒，病变区域细胞核和细胞质均无着色为阴性。MSI结果判定标准：微卫星稳定（MSS）：4个MMR蛋白均为阳性；低度微卫星不稳定（MSI-L）：只有1个MMR蛋白表达缺失；高度微卫星不稳定（MSI-H）：MMR系中出现2个或3个MMR蛋白表达缺失。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组MMR系MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白表达情况比较

复杂性非典型增生组患者的MLH1、MSH2、PMS2失表达率明显高于其他三组，且四组患者的MLH1、MSH2、PMS2失表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），但四组MSH6失表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 四组MMR系蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6失表达率比较［n（%）］

2.2四组MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型比较

MSI-H、MSI-L和MSS在单纯性增生组、复杂性增生组、单纯性非典型增生组及复杂性非典型增生组中的表型分布比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 四组MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型比较［n（%）］

表3 非典型增生患者的MSI和MSS表型与年龄的关系［n（%）］

2.3 非典型增生患者的MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型与年龄的关系

在单纯性非典型增生组和复杂性非典型增生组中，年龄≤50的患者的MSI-H及MSS表型明显高于年龄＞50岁患者，MSI-L表现明显低于年龄＞50岁患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

MMR系统最早发现于大肠杆菌中，是人体细胞控制基因变异、维持基因稳定的重要基因。MMR系蛋白能够特异性地识别并纠正DNA碱基的错误配对，减少基因的自发性突变，维持遗传稳定性和完整性。MSH6和MSH2蛋白在DNA复制过程中结合形成一种杂合的蛋白质二聚体复合物（MutS-a），其进入到DNA碱基错配区域，与二聚体MutL-a（由MLH1和 PMS2形成，能够识别新生DNA链中的错误配对碱基）结合，MutL-a和MutS-a结合到错配位点后，修复反应则立即启动［5］。在连接酶、聚合酶、内切酶、及DNA解旋酶的作用下，碱基错配区域的DNA片段被切除且重新合成并链接正确的DNA序列，从而产生修复错配碱基的作用。由于子宫内膜细胞的DNA复制频繁，有着较高的碱基错配率，因此MMR基因的突变率也较高［6］。MMR基因突变会导致机体中MMR系统的修复功能障碍，MMR系蛋白失表达，无法修复细胞在DNA复制过程中的缺失与错误掺入，出现“滑链错配”、复制错误、染色体交换不均等现象，从而导致微卫星DNA长度改变，发生MSI，正常细胞的增殖调控受到影响，出现广泛的肿瘤易感，同时快速积累某些抑癌基因及癌基因中的突变，进而引发肿瘤形成［7-9］。

MSI是在子宫内膜样腺癌患者中发生的分子事件，近年来，其作为肿瘤患者早期诊断、病情发展及预后评价的重要手段已成为学者们的研究热点。MSI作为一种肿瘤形成机制，是继抑癌基因和癌基因之后的又一重大进展［4］。相关研究发现，功能蛋白的缺陷及MMR基因的突变多出现在MSI表型的肿瘤患者细胞中，MMR基因产生修复功能障碍，从而无法修复在DNA复制过程中出现的碱基缺失或错配，表现出MSI-H［10-11］。目前，有关MSI的检测已作为鉴别MMR基因突变肿瘤的重要方法。受到多种刺激因素的作用，子宫内膜发生增生活跃现象，细胞中的DNA频繁复制，从而增加了碱基的错配率，MMR基因突变继而引发蛋白缺陷，发生MSI。有研究指出，癌症肿瘤中MSI-H表型的预后及生物学行为显著不同于MSI-L及MSS表型的肿瘤［12-13］。目前，研究普遍认为子宫内膜癌的发病通常经历子宫内膜复杂型增生到不典型增生再到癌的发展过程。若不进行治疗，则有20%～52%的子宫内膜不典型增生患者可能发展为子宫内膜癌［1］。

有研究发现，合并MLH1突变的PTEN突变子宫内膜不典型增生小鼠在短期内就会发生癌变，表明MLH1的突变促进了子宫内膜癌的形成［14］。本研究比较了四组患者的MLH1、MSH2、PMS2及MSH6蛋白的失表达率，结果显示，复杂性非典型增生组患者的MLH1、MSH2、PMS2的失表达率分别为20.0%、24.0%和16.0%，明显高于其他三组，MLH1、MSH2、PMS2的失表达率在单纯性增生组、复杂性增生组、单纯性不典型增生组及复杂性不典型增生组中逐渐升高，且差异均有统计学意义（P＜0.05），但四组MSH6的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。说明随着病变发展，MMR蛋白的修复功能逐渐丧失。在正常的子宫内膜中，MMR蛋能够纠正碱基错配，而在不典型增生组织的细胞中，MMR蛋白有不同程度的失表达，说明子宫内膜出现增生异常时，细胞的MMR功能会降低甚至丧失，从而提高肿瘤发生的可能性［15］。

Sherman等［16］研究指出，子宫内膜样腺癌和子宫内膜不典型增生的分子生物学改变十分相似，28%的不典型增生和子宫内膜样腺癌会出现MSI。Taina等［17］分析不同子宫内膜组织中的MSI表型，结果指出对于子宫内膜复杂性增生，其作为癌前病变伴或不伴非典型增生同样重要。本研究中，从正单纯性增生、复杂性增生、单纯性非典型增生到复杂性非典型增生，其MSI表型的比率逐渐上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中复杂性不典型增生组中的MSI-H、MSI-L表型分别占18.0%和24.0%，单纯性不典型增生组中分别占12.0%和20.0%。说明MSI不仅仅是发生在子宫内膜癌中的分子事件，可能在癌前病变中已经存在。相关研究表明，子宫内膜非典型增生与子宫内膜癌属同一谱系，MSI表型的子宫内膜非典型增生更可能发展为癌［18］。

发病年龄是临床肿瘤研究中的一个重要方面，通过在高危发病年龄人群中选出MMR基因突变患者，有利于肿瘤的早期诊断及预防。研究指出，子宫内膜非典型增生患者多处于围绝经期，平均年龄为（50± 11）岁，本研究中单纯性非典型增生患者的平均年龄为（45.5±1.6）岁，复杂性非典型增生组的平均年龄为（46.2±2.1）岁。本研究进一步探讨了非典型增生患者的MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型与年龄的关系，结果显示无论在单纯性非典型增生组还是在复杂性非典型增生组中，MSS和MSI-H表型在年龄≤50岁的患者中所占比例明显高于年龄＞50岁的患者，而MSI-L表型在年龄＞50岁患者中所占比例显著高于≤50岁患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。目前，MSI-H表型被视为一个独立群体，在低分化肿瘤中有着较高的比例。本研究结果提示，患者的年龄与非典型增生中MSI-H表型存在相关性。但由于目前医学上对MSI-L的定义尚未明确，其在病变中所占比例及特点尚未清楚，有待进一步研究探讨。

综上所述，MMR蛋白的失表达及MSI是在子宫内膜非典型增生病变中就已发生的分子事件，检测高危人群MMR蛋白的失表达，确定MSI存在与否对病变的早期预防及诊断具有重要意义。

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Expression of mismatch repair protein in endometrial hyperplasia tissues of patients with atypical hyperplasia of endometrium

LIU Caihong1CHEN Zhiqiang2
1.Department of Pathology，Maternity and Child Care Centers of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China；2.Department of Urology，Central Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China

Objective To explore the expression of mismatch repair（MMR）gene proteins and microsatellite instability（MSI）in atypical endometrial hyperplasia.Methods 200 endometrial hyperplasia tissues from October 2005 to June 2015 in the Central Hospital of Chengde City were selected，and they were divided into the simple hyperplasia group（50 cases），complexity hyperplasia group（50 cases），simple atypical hyperplasia group（50 cases）and complexity atypical hyperplasia group（50 cases）according to hyperplasia type.Immunohistochemical method was used to detect the expressions of DNA mismatch repair proteins（MLH1，MSH2，PMS2 and MSH6）in four groups；the non-expression rate of MMR were compared between four groups；the relationships between MSI（MSI-L，MSI-H）and age of atypical hyperplasia group was also observed.Results The non-expression rate of MLH 1，MSH2，PMS2 and MSH6 were the highest in the complexity atypical hyperplasia group，and non-expression rate of MLH1，MSH2，PMS2 in the simple atypical hyperplasia group，complexity hyperplasia group and simple hyperplasia group were decreased progressively，the differences were statistically significant（P＜0.05）；while there was no statistically significant difference in the non-expression rate of MSH6 in the four groups（P＞0.05）.There were statistically significant differences in phenotypes of MSIH，MSI-L and MSS in the four groups（P＜0.05）.There were statistical significance in the expression of MSI-H，MSIL and MSS between patients who age≤50 years and＞50 years in the atypical hyperplasia group（P＜0.05）.Conclusion MSI and the negative expression of MMR proteins may be one of the important molecular events of patients with atypical endometrial hyperplasia.

Atypical endometrial hyperplasia；Mismatch repair gene；Microsatellite instability；Immunohistochemistry

R735.2

A

1673-7210（2016）07（b）-0080-04

2016-04-02本文编辑：任念）

河北省医学科学研究重点课题计划项目（2016 0289）。