陈申秒，牛成明，翟庆贺，何福庆，杨灵芝

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东 滨州 256600；2.山东博莱威生物技术研究所，山东 滨州 256606）

猪流行性腹泻病毒培养的工艺参数优化试验

陈申秒1，2，牛成明1，2，翟庆贺2，何福庆2，杨灵芝1，2

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东 滨州 256600；2.山东博莱威生物技术研究所，山东 滨州 256606）

为了提高猪流行性腹泻病毒的病毒滴度，建立最优的病毒培养条件，对影响病毒培养的细胞培养时间、接毒剂量、收毒时间等条件进行了研究。结果表明：细胞培养时间为主要因素，对于流行性腹泻病毒毒价影响较为显著，细胞培养72 h接毒平均毒价为107.44TCID50/0.1 mL，均高于其他两组；而收毒时间则为次要因素，平均毒价为107.21TCID50/0.1 mL；接毒剂量影响不显著，平均毒价为107.08TCID50/0.1 mL，本试验最佳工艺组合为细胞培养72 h接毒、接毒剂量为0.1%、收毒时病变程度为60%。

猪流行性腹泻病毒；细胞培养；佐剂

使用PEDV灭活疫苗是目前防治猪流行性腹泻的主要手段，但目前市场上的灭活疫苗普遍反映效果不理想，主要原因在于病毒培养难度大，病毒抗原很难达到很高的水平。有试验表明，如果乳汁中有高水平的IgG可以保护仔猪免受感染，这要求妊娠母猪免疫肌肉注射剂量每次不应少于107.0TCID50/mL，而且应进行两次免疫才能激发产生高水平中和抗体［1］。我国很早就在Vero细胞上培养PEDV，但是其来源的差异、毒株间的差异及培养条件对于PEDV的分离培养影响很大，不同学者所报道的方法在胰酶浓度、培养时间等方面差距较大［2］，建立高病毒含量的生产工艺在实际生产中意义重大。为进一步优化生产工艺、提高半成品毒价，本研究从细胞培养时间、接毒剂量、收毒时间入手，研究三个因素对于半成品毒价影响的主次关系，以期筛选到最佳工艺组合，为腹泻发生提供依据。

1　试验材料

1.1细胞传代后48 h大转瓶Vero细胞，共18瓶，由灭活细胞苗车间提供。

1.2种毒PEDV-CV777 F79（F4），生产种毒，毒价为107.6TCID50/0.1 mL，-70℃保存，批号为140107；

1.3其他耗材MEM MD600，购自北京清大天一科技有限公司；新生牛血清，购自济南劲牛；96孔细胞培养板等。转瓶机，微量移液器，37℃温室，细胞培养箱等。

2　试验方法

2.1腹泻培养工艺的优化选取Vero细胞长至较密单层的大转瓶6个，按照1∶3比例，均匀传至18个大转瓶，待细胞长至单层后备用。将18个大转瓶Vero细胞随机分组，按照正交试验表分组接毒，共分为9组，每组2个重复。

表1　腹泻工艺优化正交试验设计

接毒后逐日观察细胞病变情况，按照细胞病变的程度分别收获，冻融2次后，取样，用于毒价测定。大转瓶接毒工艺：选取长至需要时间的大转瓶细胞，弃去营养液，加入2%血清的MEM［含终浓度为100 IU（μg）/mL的双抗］，1 000 mL/瓶，加入需要剂量的种毒（如1%接毒剂量，即加入10 mL种毒/瓶），摇匀，置于37℃培养，24 h后随时观察病变情况，当病变程度达到要求比例时（如90%细胞发生病变），收取大转瓶，置于-20℃冻存，冻融2次，取样，用于毒价测定。

2.2病毒毒价的测定按照常规方法培养Vero细胞，将细胞消化后铺于5块96孔细胞培养板内，待长满单层，弃去培养液，取维持液稀释好的病毒样品，10-5至10-8稀释度，加入上述96孔板内，每个稀释度6个重复，每孔100 μL，置于细胞培养箱培养96 h，逐日观察，记录病变情况，计算TCID50。

测定结束后，再对样品进行1次重复测定，若两次测定结果吻合，则分析数据，得出结论；反之，则需进行第3次重复测定。

3　试验结果

3.1接毒病变及毒价测定情况按照方案，分别于细胞传代后24、48、72 h接毒，并按照不同的病变程度收毒，取样后进行两次毒价测定，对于两次毒价测定结果差异较大样品，分别重新测定两次，最后取毒价指数平均值，作为该样品的毒价。具体数据见表2、图1。

3.2结果的统计分析利用极差分析方法，对细胞传代后不同时间、接毒剂量、病变程度等组合的累加毒价、平均毒价进行计算，进而计算各组内平均毒价的最大差距，即极差数值（R），并根据各组间极差的大小，判定主次因素对于毒价的影响程度，结果显示：细胞传代培养时间R值为0.41，大于病变程度的R值（0.35），大于接毒剂量的R值（0.27）。因此，对于毒价影响的主次因素依次为细胞培养时间、病变程度、接毒剂量。

表2　各分组接毒、收毒及毒价测定情况

图1　不同试验组的平均毒价分布

利用SPSS软件进行显著性分析，结果与极差分析结果一致。细胞培养72、48 h均显著高于24 h；病变在60%时收毒，显著好于90%；接毒剂量为0.01%时，略好于其他接毒剂量，但差异不显著。

通过上述分析，最佳组合方案为细胞传代后72 h接毒、接毒剂量为0.01%、病变在60%时收毒，预期毒价较好。具体统计分析结果见表3、图2。

表3　正交试验统计分析

图2　不同条件下毒价均值分布情况

4　讨论

由上述试验结果可知，细胞培养144 h接毒，对于腹泻病毒毒价的影响较大。这表明，细胞密度对于腹泻病毒的大量增殖是必要的。因此，提高腹泻病毒毒价，关键是提高Vero细胞的培养密度。那么提高培养密度，除延长细胞培养时间外，还可以通过增大细胞培养面积的方法，例如生物反应器。

此外，在Vero细胞的传代培养过程中发现，试验所用Vero细胞系中存在两种形态的细胞，即马赛克形和梭形（类似柳叶性状）。其中，梭形Vero细胞生长较为迅速、且后期细胞密度较大，对于腹泻病毒增殖较为有利；而马赛克形的细胞则增殖较为缓慢，且后期细胞密度相对较低，对于腹泻病毒增殖可能不利，具体情况还得进一步试验证实。

5　结论

本试验最佳工艺组合为细胞培养72 h接毒，接毒剂量为0.1%，收毒时病变程度为60%；优势组合为：细胞培养72 h接毒，接毒剂量为10%，收毒时病变程度为75%；细胞培养48 h接毒，接毒剂量为0.1%，收毒时病变程度为75%。

［1］Calvo E，Escors D，Lopez J A，et al.Phosphorylation and subcellularlocalization of transmissible gastroenteritis virus nucleocapsideprotein in infected cell［J］.J Gen Virol，2005，86：2255-2267.

［2］陈申秒，牛成明，何福庆，等.猪流行性腹泻病毒研究进展及疫苗研究前景［J］.中国畜牧兽医，2014，41（3）：223-229.

S852.65+1

B

0529-6005（2016）04-0117-02

2014-12-01

山东省自主创新成果转化重大专项（2010ZHZX1A 0417）

陈申秒（1983-），男，助理研究员，硕士，从事动物传染病的诊断与防治工作，E-mail：csmiao.science@163.com