陶　政，曾文斌，刘悦欣，左明开，幸文定，白帅州，张学良，王　萍

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045；2.南昌市动物疫病预防控制中心，江西 南昌 330008）

猪源产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法的建立及应用

陶政1，曾文斌1，刘悦欣1，左明开1，幸文定1，白帅州1，张学良2，王萍1

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045；2.南昌市动物疫病预防控制中心，江西 南昌 330008）

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌（ETEC）检测方法，根据产肠毒素大肠杆菌菌毛（K88）和毒素（STa和LT）基因分别设计合成了1对引物，对K88、STa和LT基因扩增条件进行优化，建立了检测K88、STa和LT的三重PCR方法。该方法对K88、STa和LT基因的扩增产物分别为499 bp，190 bp和373 bp；此外，该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的三重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的三重PCR方法对实验室从临床腹泻样品中分离的120株大肠杆菌进行检测，结果9株为K88/LT/STa阳性，14株为K88/LT阳性，21株K88/STa阳性，13株LT/STa阳性，8株K88阳性，2株LT阳性，12株STa阳性。

产肠毒素大肠杆菌；三重PCR；K88菌毛；STa毒素；LT毒素

能够引起仔猪产生腹泻的最常见的病原型大肠杆菌有产肠毒素（enterotoxigenic，ETEC）、肠出血性（enterohaemorrhagic，EHEC）、肠致病性（enteropathogenic，EPEC）、肠侵袭性（enteroinvasive EIEC）和产志贺菌毒素（shiga toxin producing STEC）大肠埃希菌。其中，ETEC是最常见一种致病性大肠埃希菌，能够引起仔猪急性水样腹泻和迅速脱水死亡，死亡率和发病率均很高，这给养殖业带来了严重的经济损失。

产肠毒素大肠杆菌性腹泻主要发生于集约化的养猪场和种猪场，常引起0～6日龄新生仔猪和3～6周龄断奶仔猪的腹泻。ETEC主要包括肠毒素和粘附素两种毒力因子。粘附素也称为菌毛，主要有K88、K99、987P、F17、F18和F41［1］，其中K88是引起我国仔猪腹泻的主要ETEC菌毛。相比于种类繁多的菌毛，肠毒素只有热敏肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）两个主要类型，二者均由质粒编码［2］，其中ST包含STa与STb两种［3］。ETEC菌株可单独产生ST或LT，或两种毒素同时产生［4］。

目前检测大肠杆菌毒素的方法主要有动物试验、凝集试验、琼指扩散试验，这些方法不仅费时费力，而且具有一定的局限性［5-6］。随着分子生物学技术的不断发展，PCR技术具有特异、敏感、快速等优点［7］。本试验设计了3种大肠杆菌毒素基因特异引物，建立检测ETEC的K88、STa和LT基因三重PCR检测方法，为ETEC的检测及鉴定提供了有效的方法。

1　材料与方法

1.1菌株C83902（K88+、LT+和STa+），购自中国兽医药品监察所；沙门菌、猪丹毒杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌和鸭疫里默菌和临床分离的120株E.coli分离株，均由江西农业大学预防兽医细菌研究室保存。

1.2主要试剂及培养基Taq DNA Polymerase、dNTPs、Trans2K DNA Marker，均购自北京全式金生物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基和普通营养琼脂培养基由本实验室配制。

1.3引物设计与合成根据GenBank登录中的序列（登录号：M25302、M58746和AB011677），针对ETEC的3种毒力基因（K88、STa和LT）设计了3对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表1　ETEC毒力基因多重PCR引物

1.4DNA模板的制备按文献［5］的方法，采用煮沸方法提取细菌DNA。

1.5PCR反应条件的优化PCR扩增体系为25 μL，所用模板DNA 2.5 μL。试验以含K88、STa和LT基因的C83902菌株作为模板，分别对影响PCR扩增的dNTPs浓度、引物浓度、退火温度等因素进行优化。在确定了dNTPs和退火温度后，优化引物浓度。

1.6三重PCR的敏感性试验将标准菌株C83902于37℃振荡（140 r/min）15 h，取培养菌液倍比稀释为101CFU/mL到105CFU/mL，各浓度稀释液分别作为PCR模板，进行三重PCR扩增，测定反应的灵敏性。

1.7三重PCR扩增的特异性分别对标准菌株C83902、猪丹毒杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌株和鸭疫里默菌株进行检测，以确定三重PCR方法的特异性。

1.8对E.coli分离菌株的检测采用建立的多重PCR方法对实验室从仔猪临床腹泻样品中分离的120株E.coli分离菌进行PCR检测鉴定，并对结果进行分析。

2　结果与分析

2.1三重PCR扩增条件的检测和优化结果三重PCR方法对K88、STa和LT 3种基因的扩增产物分别为499 bp，190 bp和373 bp；通过对影响PCR扩增的dNTP浓度、引物浓度以及退火温度等因素进行优化。该多重PCR扩增体系最终确定为：dNTPs（0.4 mmol/L）3 μL，10×PCR Buffer 7 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.8 μL，双蒸水10 μL，模板DNA 2.5 μL，K88、LT和STa的上下游引物（20 μmol/L）分别为0.25 μL、0.25 μL和0.35 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性50 s、53℃退火30 s、72℃延伸60 s，33个循环；72℃延伸10 min（图1）。

图1　不同温度下ETEC的多重PCR扩增结果

2.2三重PCR扩增的灵敏性对标准菌株模板10倍倍比稀释，利用优化好的多重PCR扩增条件进行PCR灵敏性检测，结果显示，C83902标准菌株三重PCR反应的最低灵敏度为103CFU/mL（图2）。

2.3三重PCR扩增的特异性利用优化好的多重PCR扩增条件，将对照菌株和标准菌株进行PCR检测，结果显示，标准菌株C83902扩增出了K88、STa和LT三个基因片段，而其他菌株则没有出现任何条带（图3）。

2.4对E.coli分离菌株的多重PCR检测采用多重PCR方法对实验室分离的120株E.coli进行检测，结果检出ETEC阳性79份，即ETEC的检出率为65.8%，其中K88/LT为17.7%（14/79），K88/STa为26.6%（21/79），LT/STa为16.5%（13/79），K88+LT+STa为11.4%（9/79），L T为48.1%（38/79），STa为69.6%（55/79），K88+为65.8%（52/79）。表明产肠毒素大肠杆菌江西分离株的主要毒力基因型是STa和K88的毒力表型。

图2　多重PCR扩增敏感性实验

图3　多重PCR扩增特异性实验

3　讨论

引起仔猪出现腹泻性症状的病原有很多种，而ETEC感染只是其中的一种病原，所以要仔猪腹泻是否是由产肠毒素大肠杆菌感染导致，仅从病理解剖和临床症状只能做出初步诊断，而必须依赖于病原学的检测，并对产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学进行调查研究。

多重PCR技术能够在同等的时间内对多条靶基因进行扩增，相比常规的PCR而言，不仅更高效，而且能够在分子水平上适应大批量样品的快速检测［8-9］，为仔猪等动物细菌性腹泻提供了有效快捷的研究手段。本试验所建立的产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法中，对产肠毒素大肠杆菌的粘附素K88、肠毒素LT和STa，大小分别为499 bp、373 bp和190 bp的基因片段进行扩增，即可在一次PCR中方便的检测出这3种毒力基因。通过对三重PCR反应的dNTP浓度、反应敏感性、特异性和退火温度等条件进行优化，最终确定dNTP终浓度为0.4 mmol/L，K88、LT和STa引物终浓度均为20 μmol/L，引物的最佳退火温度为53℃，三重PCR的敏感性检测最低可达103CFU/mL，所建立的多重PCR具有高度的特异性。

对江西临床上发病的120份仔猪腹泻病料进行检测，通过建立的多重PCR检测方法进行扩增，得到了79份阳性的产肠毒素大肠杆菌，即ETEC的检出率为65.8%，其主要表型毒力基因型是STa和K88，分别占到了69.6%（55/79）和65.8%（52/79），表明产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪腹泻比较严重。建立多重PCR检测方法可以从基因水平检测ETEC，

通过对样品增菌后即用于PCR检测，不但可以快速鉴定是否存在ETEC感染，而且具有检出率高的优点，更适合于临床大批样品的检测，对仔猪等动物细菌性腹泻的快速临床诊断具有一定的临床意义，也为ETEC引起的其他类似流行性疾病提供了有效快捷的研究手段。

［1］Blanco M，Lazo L，Blanco J E，et al.Serotypes，virulence genes，and PFGE patterns of enteropathogenic Escherichia coli isolated from Cuban pigs with diarrhea［J］.Int Microbiol，2006，9（1）：53-60.

［2］Johnson T J，Nolan L K.Pathogenomics of the virulence plasmids of Escherichia coli［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2009，73（4）：750-774.

［3］Nataro J P，Kaper J B.Diarrheagenic Escherichia coli［J］.Clin Microbiol Rev，1998，11（1）：142-201.

［4］Taxt A，Aasland R，Sommerfelt H，et al.Heat-stable enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli as a vaccine target［J］.Infect Immun，2010，78（5）：1824-1831.

［5］华荣虹，张书霞，何孔旺.猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2006（02）：162-164.

［6］曾群辉，陈明勇，张冰，等.牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验［J］.中国预防兽医学报，2001（04）：47-48.

［7］闻晓波，崔玉东，朱战波，等.牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2007（03）：322-324.

［8］关怡，黄天培，潘洁茹.应用多元PCR鉴定水体中大肠杆菌的毒素基因［J］.中国农学通报，2010（16）：40-43.

［9］曲泽慧，陈佩佩，张爱芹，等.产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2012（12）：980-982.

Development and Application of triplex PCR Detection of porcineEnterotoxigenic E.coli

TAO Zheng1，ZENG Wen-bin1，LIU Yue-xin1，ZUO Ming-kai1，XING Wen-ding1，BAI Shuai-zhou1，ZHANG Xue-liang2，WANG Ping1
（1.College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.NanChang Center for Diseases Prevention and Centrol，Nanchang 330008，China）

To establish a simple，sensitive，accurate and rapid method for the detection of Enterotoxigenic E.coli（ETEC）in pigs，a triplex PCR method was developed based on 3 pairs of primers for the fimbriae genes（K88）and 2 toxin genes（STa，LT）amplification.The reference E.coli strains which passed the different virulence genes were detected.The results showed that 499 bp，190 bp and 373 bp DNA fragments of K88，STa and LT genes were amplified by this protocol，respectively.The triplex PCR was proved to be specific and sensitive.Furthermore，a total of 120 E.coli were tested and theresults showed that 9 samples were K88/ LT/STa positive，14 sample was K88/LT positive，21 sample was K88/LT positive，13 sample was K88/STa positive，8 sample was K88 positive，2 sample was LT and 12 sample was STa positive.The triplex PCR assay provides a method to detect ETEC which causes diarrhea in piglets.

Enterotoxigenic Escherichia coli；Triplex PCR；K88 fimbriae；STa toxin；LT toxin

WANG Ping

S852.61

A

0529-6005（2016）04-0102-03

2015-01-29

江西省科技厅基金项目（20142BBF 60004）

陶政（1991-），男，硕士生，研究方向为动物免疫学基础理论与运用，E-mail：1552372174@qq.com

王萍，E-mail：jxjs6263wplm@163.com