马齿苋不同提取物对肠炎沙门菌的体外抑菌试验

2016-11-15周孝琼陈慧芳王喜娣钟雪香张秋诗

中国兽医杂志 2016年4期

关键词：高敏提物水提物

周孝琼，王　华，陈慧芳，王喜娣，刘　娴，钟雪香，张秋诗

（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012；2.福建省预防医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩 364012）

马齿苋不同提取物对肠炎沙门菌的体外抑菌试验

周孝琼1，2，王华1，2，陈慧芳1，王喜娣1，刘娴1，钟雪香1，张秋诗1

（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012；2.福建省预防医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩 364012）

采用牛津杯法和平板法观察马齿苋水提物、醇提物和水煮醇提物对肠炎沙门菌的抑制作用。结果表明，马齿苋水提物和醇提物浓度为1 g/mL时，肠炎沙门菌对其表现为极敏；对水煮醇提物表现为高敏。提取物浓度为0.5 g/ mL时，肠炎沙门菌对水提物表现为极敏；对醇提物和水煮醇提物表现为高敏。浓度为0.25 g/mL时，肠炎沙门菌对马齿苋水提物和醇提物表现为高敏；对水煮醇提物表现为中敏。3种提取物对肠炎沙门菌的MIC和MBC分别为0.025、0.025 g/mL和0.050 g/mL

马齿苋；提取物；肠炎沙门菌；体外抑菌

马齿苋又名长寿菜，是一种长在田间地头的常见野菜。一般茎为红褐色，叶片绿色、对生、肥厚，为长倒卵形，全草均可入药，分布在全世界温热带地区。马齿苋作为我国传统中药在民间已有数千年的应用历史，我国历代本草医书对马齿苋都有记载。其还是我国卫生部划定78种药食同源的野生植物之一［1］，它含有多种对人体有益的营养成分和药用成分，具有很高的营养价值和药用价值。现代药理研究表明有抑菌、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等多种功用［2］。肠炎沙门菌属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一，宿主包括人和各种动物。该菌主要引起畜禽的胃肠炎和人类肠炎和食物中毒。近年来，肠炎沙门菌已成为引起胃肠炎和食物中毒的主要病原菌之一。随着由沙门菌引起的病例不断上升，该菌不但严重阻碍了养禽业的发展，而且还威胁着人畜健康，已成为公共卫生所关注的问题。本试验研究了马齿苋3种不同工艺制得的提取物对肠炎沙门菌的抑菌试验，取得理想效果，为马齿苋的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料中药马齿苋，采自福建省龙岩市东肖镇田野，经本校植物学教授鉴定为马齿苋科一年生草本植物。秋季全草采收，水洗，切碎于50℃烘箱中烘干备用。菌种：肠炎沙门菌，ATCC13076，购自上海瑞楚生物科技有限公司。LB培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

超声波细胞粉碎机，SCIENTZ-ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发仪，N-1100，上海爱朗仪器有限公司制造；一体式超纯水系统，labtower15EDI，美国热电；大容量高速冷冻离心机，ST 16R，美国热电；电子灭菌试验装置，HVE-50，日本Hirayama；电子分析天平，AL104-1C，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1水提物的制备将马齿苋10 g分别用10、8、6倍量超纯水浸泡蒸馏煮提3次，去渣，合并3次滤液，经旋转蒸发仪浓缩至10 mL，即得1 g/mL的药液，经高压灭菌备用［3］。

1.2.2醇提物的制备将马齿苋用粉碎机粉碎，过40目筛备用。称取10 g，加入10倍量70%乙醇，加盖浸泡30 min。用超声波细胞粉碎机于50℃，超声功率20%，超声工作2 s间歇3 s，总时间为10 min。然后于65℃恒温水浴浸提2 h，抽滤并保留滤液，滤渣再用等量70%乙醇于65℃恒温水浴浸提2 h，抽滤。合并两次滤液，经离心机4 000 r/min离心10 min，分离弃沉淀物制得样品原液。进一步经旋转蒸发仪在真空度为0.09 Mpa 60℃下真空浓缩至10 mL，即得1 g/mL的浓缩液［4-8］，经高压灭菌备用。

1.2.3水煮醇提物的制备将马齿苋10 g分别用10、8、6倍量超纯水浸泡蒸馏煮提3次，第一次回收蒸馏液，去渣，合并3次滤液，4层纱布过滤，经旋转蒸发仪浓缩至10 mL。加入无水乙醇，使乙醇浓度达75%，调节pH值于6.8-7.2，冰箱冷藏浸提48 h后，滤纸过滤去除沉淀物质，旋转蒸发仪回收乙醇，冷却后再次加入无水乙醇，使其浓度达85%，重复以上操作，回收乙醇，最后加入1 mL蒸馏成分，和0.5 mL吐温-80充分混合后用无菌水调节至10 mL，即得1 g/mL的浓缩液。高压蒸汽灭菌备用［9］。

1.2.4菌种的复壮与扩增肠炎沙门菌接种于LB固体培养基上，37℃培养18～24 h，复壮后，取菌种一环置于LB液体培养基内，37℃培养24 h，再用肉汤液做1∶500倍稀释备用。

1.2.5牛津杯法取菌液100 μL置于LB琼脂平板表面，用涂布器反复涂布均匀后置于37℃恒温箱中10 min，表面干燥后取出，在每个平板上等距离平放打有标记的牛津杯6只，每只杯内分别加入等量的不同浓度的药液240 μL，于37℃培养24～48 h，每种浓度设置6个重复。

1.2.6最小抑菌浓度试验采用平板法，用超纯水按试管二倍稀释法稀释提取物的5种不同浓度：1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g/mL，分别按1∶9的比例在已融化的营养琼脂培养基中加入每一种稀释倍数的提取物，使药物浓度为：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 g/mL，对照用10 mL营养琼脂培养基，包扎好高压灭菌，待温度降至50℃左右倒入60 mm灭菌的培养皿中。待冷却凝固后放入37℃温箱中干燥2 h，取出平皿冷却后加入50 μL菌悬液，用灭菌涂布器涂均匀，再放入37℃温箱培养24 h，对照平皿不加菌液。每种提取物设3个重复。

1.2.7抑菌试验结果判断抑菌效果判定，抑菌直径≥20 mm为极敏，用“++++”表示；15～19 mm为高敏，用“+++”表示；10～l4为中敏，用“++”表示；10 mm以下为低敏，用“+”表示；无抑菌圈为耐药［10］。

1.2.8最低抑菌浓度结果判断在对照皿无细菌生长的前提下记录结果，“-”表示平板无细菌生长，“+”表示平板有细菌生长，

2　结果

2.1抑菌试验结果3种提取物3种浓度对肠炎沙门菌的抑菌效果见表1。从表1可以看出，马齿苋水提物和醇提物浓度为1 g/mL时，肠炎沙门菌对其表现为极敏，对水煮醇提物表现为高敏。提取物浓度为0.5 g/mL时，肠炎沙门菌对水提物表现为极敏，对醇提物和水煮醇提物表现为高敏。浓度为0.25 g/mL时，肠炎沙门菌对马齿苋水提物和醇提物表现为高敏，对水煮醇提物表现为中敏。

表1　3种提取物3种浓度对肠炎沙门菌的抑菌效果（平均抑菌圈直径mm）

2.2最低抑菌浓度试验结果见表2。

表2　3种提取物对肠炎沙门菌的最小抑菌浓度（g/mL）的抑菌效果

从表2可知，马齿苋水提物、醇提物和水煮醇提物对肠炎沙门菌的最小抑菌浓度分别为0.025、0.025 g/mL和0.050 g/mL。

3　分析与讨论

3.1马齿苋性寒，味甘酸；入心、肝、脾、大肠经，具有清热解毒，凉血止血，止痢的功效。马齿苋3种提取物同浓度对肠炎沙门菌均有显著的抑菌作用，且随药物浓度的增加而增强。在实践中，马齿苋常用来防治畜禽下痢，可单用或和其他药物配伍使用。其中水提物略优于醇提和水煮醇提物，但不易保存。水煮醇提工艺可制成注射液，使用方便，见效快。在生产实践中，可以根据季节及生产条件，选择合适的提取工艺。

3.2马齿苋水提物和醇提物在浓度为0.025 g/mL时，平皿无细菌生长，在0.0125 g/mL时，有细菌生长；水煮醇提物在浓度为0.05 g/mL时，平皿无细菌生长，在0.025 g/mL时，有细菌生长，因此3种提取物对肠炎沙门菌的最小抑菌浓度（MIC）即为最小杀菌浓度（MBC）。

3.3马齿苋含有黄酮类、萜类、香豆素类、生物碱类、挥发油类及多糖类等多种活性成分［2］。马齿苋提取物是多种物质的混合物，其中究竟是何种物质对肠炎沙门菌具有抑制作用，有待进一步研究。

3.4马齿苋适应性极强，易于人工大量栽培，且价格低廉。随着健康、绿色、安全、生态养殖的倡导，中草药在畜牧养殖中的开发得到广泛关注，因马齿苋的气味和味道不具有通常中草药的苦味，适口性好，广泛应用于畜禽饲料中。本试验为马齿苋作为畜牧业新型绿色中草药添加剂，减少抗生素的使用和提高食品安全性，同时也为中药现代化提供理论依据。

［1］卫法监发＜2002＞15号，《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》［s］.

［2］冯津津.马齿苋的化学成分及药理作用研究进展［J］.云南中医中药杂志，2013，34（7）：66-68.

［3］杨明凡，张素梅，唐湛伟，等.马齿苋不同加工方法对体外抑菌效果的影响［J］.中兽医医药杂志，2006，5：19.

［4］张京芳.马齿苋黄酮类物质提取工艺研究［J］.西北林学院学报，2004，19（4）：123-126.

［5］章爱华，邓斌，陈小原.马齿苋中黄酮类化合物的提取工艺研究［J］.农产品加工：学刊，2008（5）：18-19.

［6］魏循，王仲英.马齿苋总黄酮含量的测定［J］.光谱实验室，2003，20（1）：128-129.

［7］黄春红，殷武平，郝小花.野生马齿苋草粉总黄酮的提取及含量测定［J］.湖北农业科学，2011，50（7）：1462-1464.

［8］秦学会，阮美娟，赵龙，等.响应面法优化超声波水提马齿苋黄酮的工艺［J］.天津科技大学学报，2009，24（1）：19-21.

［9］南京药学院.药剂学［M］.北京：人民卫生出版社，1978：269.

［10］李利红，陈忠杰，卢婷婷，等.几种香料植物提取物对大肠杆菌抑制作用的试验［J］.中国兽医杂志，2013，49（6）：54-56.

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