张振东，王广文，胡东方，牛玉娟，张民霞，吕传位，吕　林，张清林，肖一红，刘思当

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000；2.泰山职业技术学院生物系，山东 泰安 271000）

一起绵羊伪狂犬病的发生及病毒gE基因的序列变异分析

张振东1，王广文1，胡东方1，牛玉娟1，张民霞1，吕传位1，吕林1，张清林2，肖一红1，刘思当1

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000；2.泰山职业技术学院生物系，山东 泰安 271000）

为了确诊一起绵羊伪狂犬病的发生，采集送检病羊的皮肤、脾脏、淋巴结、脑等组织器官进行实验室病毒分离和PCR检测。结果显示，病料中扩增出了伪狂犬病病毒的特异性gE基因片段。结合流行病学调查、病理剖检和实验室诊断，确定引起此次疫情的病原为伪狂犬病病毒。为了进一步了解此次疫情中PRV gE基因的分子特征，特对PCR扩增产物进行了连接、转化和测序分析。遗传进化分析表明，该分离株与亚洲各分离株处于同一分支，基因同源性高达98.4%-99.4%，与欧洲、美洲分离株同源性相对较远，分别为97.0%-97.2%、97.2%-97.3%；gE蛋白氨基酸序列分析显示，该分离株在gE蛋白的第48位和第492位各存在1个天冬氨酸的插入，与我国当前流行的伪狂犬变异株相同，同时在当前猪伪狂犬病病毒变异株基础上又出现了新氨基酸位点的变异，如L49P、P160T、V406G、G445R，其分子生物学特性有待进一步的研究。本文通过综合诊断确定该病由伪狂犬病病毒引起，为我国绵羊伪狂犬病的流行病学分析及防控提供了重要的理论依据。

绵羊伪狂犬病；济宁；gE；分离鉴定；遗传变异

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种急性热性传染病，病毒主要侵害家畜以及各种野生哺乳动物的神经系统，患病动物主要表现为发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎等症状。该病于1813年于美国牛群首次被发现，我国在1948年首次报道该病［1］。近年来，伴随着猪伪狂犬病的流行及肉羊养殖规模的扩大，PR在羊群中的发病情况日益严重，特别是发病猪场周围的羊群时有发病死亡的情况，起初多为零星散发，往往得不到足够地重视，以致后来造成羊群大面积发病，造成较大的经济损失。2014年2月18日，山东济宁地区某绵羊场发生伪狂犬病疑似病例，前来就诊，经流行病学调查、症状观察、病理剖检及实验室综合诊断，最终确诊为羊伪狂犬病。随后及时采取了综合防控措施，使疫情得到了及时有效的控制，避免了更大的经济损失。

1　背景调查

该养殖场存养绵羊220只，近两年来羊场无较大疫情发生。但于2014年2月15日下午突然出现2只病羊，表现为精神沉郁，离群站立，体温升高至41℃以上，呼吸加快，食欲减退，不食，未引起畜主的注意，但未采取任何防控措施。2月16日早上，2只病羊均已死亡，发现鼻端、唇部发生水肿，口腔有泡沫样唾液，皮肤存在擦伤，体侧部被毛脱落。畜主将病死羊掩埋处理后，用20%石灰水对羊舍进行喷洒消毒。2月18日上午，羊群又突然出现死羊1只，病羊2只，病羊表现不安、站立不稳、偏向一侧、倒地横卧，经常啃咬发痒部位，皮肤破溃出血。畜主将病羊隔离治疗，注射安痛定、头孢噻呋钠等药物，但病羊在当天先后死亡。并且羊群中陆续出现病羊，故带病羊前来就诊。

畜主介绍：羊场已经营3年，从未出现过类似病情，现今羊群发病率已超过30%，死亡率几乎100%。该羊场周边猪场较多且养猪密度大，附近猪场近段时间内母猪群繁殖障碍的比例较高，母猪流产及产死胎现象严重。

2　病理剖检

在做好人员防护措施的情况下对畜主送检的两只病羊进行了剖检。剖检发现，两只病羊的各内脏器官仅见轻微眼观病变，脸部皮下水肿有胶胨样物质沉积，腹部皮肤有擦伤、充血、出血，气管内有泡沫性黏液，肺脏水肿、充血，脑膜充血、水肿。

3　实验室诊断

3.1病毒分离采集皮肤、肝、脾及淋巴结等组织器官，按常规方法匀浆，反复冻融3次，12 000 r/min离心30 min，将上清液经0.22 μm滤器过滤后接种于铺满单层的Vero细胞，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。每天观察有无细胞病变，将培养96 h的细胞瓶取出，经-20℃冰箱反复冻融3次后，收获Vero细胞及上清，于-80℃冻存备用。

3.2PCR检测根据GenBank上公布的参考序列设计绵羊PRV gE基因的特异性扩增引物，扩增片段为2 060 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用北京全式金生物技术有限公司DNA/RNA Kit试剂盒提取细胞上清液伪狂犬病病毒DNA，取3 μL作为模板，反应体系为TaKaRa Taq 0.2 μL，2×GC Buffer 10 μL，2.5 mmol/mL dNTPs 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加Nucleasefree water至25 μL，混匀；扩增程序为95℃预变性5 min，95℃变性1 min，68℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保温。

4　结果

根据发病情况、临床症状、剖检变化以及实验室诊断，最终确定导致该场绵羊发病的病原为伪狂犬病病毒，可能由周边猪场猪源伪狂犬病病毒传播而来。通过及时采取扑杀消毒、紧急免疫、防止继发感染等综合措施［2-3］，疫情得到了有效控制，避免了更大的经济损失。

图1　细胞上清液PRV gE扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

5　序列分析

为了更深入地了解引起此次疫情的PRV的分子特征，特对PCR扩增出的gE基因目的片段进行了连接、转化和测序。

5.1PRV gE基因遗传进化分析对该绵羊伪狂犬病分离株序列分析表明，gE基因全长为1 740 bp（去除PCR扩增产物两端的多余序列），编码580个氨基酸。其与亚洲各分离株处于同一分支，基因同源性高达98.4%～99.4%，而与欧洲、美洲分离株同源性相对较远，分别为97.0～97.2%、97.2～97.3%（图2）。

5.2gE基因氨基酸位点差异分析氨基酸差异位点分析，该绵羊伪狂犬病病毒分离株与亚洲猪源伪狂犬病病毒分离株基本上完全一致，在氨基酸位点的48位和496～497位上分别出现了一个天冬氨酸（D）的插入（表1，2），另外，还出现了新的氨基酸变异点，如L49P，P160T，V406G，G445R。

6　讨论

有关羊伪狂犬病的病例以前鲜有报道，但最近12年内该病的发病率明显提高［3］，张克山、张文花等专家学者对此病例也进行了报道分析［4-5］。近年来，猪伪狂犬病暴发流行，童光志等已发现伪狂犬病病毒全基因组和编码蛋白的氨基酸序列发生了明显变异［6］，赵鸿远等［7］的研究也表明，2012后我国流行的伪狂犬病病毒以变异株为主，变异株之间具有相同的分子特征，即在gE蛋白的第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。该绵羊伪狂犬病病毒分离株在gE蛋白相应位点也存在同样的插入，说明此次在绵羊伪狂犬病疫情是由伪狂犬病变异株引起的，基因同源性高达98.4%～99.4%。该羊场周边猪场较多，猪场较为密集，且猪场近段时间内母猪产死胎及弱胎的现象严重，这些都进一步地证明该伪狂犬病病毒分离株极有可能是由猪传染给了绵羊。

图2　gE基因氨基酸序列遗传进化分析

表1　该绵羊分离株与世界各国猪源伪狂犬病病毒gE氨基酸位点差异分析

表2　该绵羊分离株与世界各国猪源伪狂犬病病毒gE氨基酸位点差异分析

我国规模化养猪场均使用Bratha-k61疫苗来免疫伪狂犬病，长期以来起到了良好的预防效果［8-9］。对于该病多发区疫苗免疫仍是防控羊伪狂犬病最为有效的方法，同时也建议羊场采取以下防控措施：第一：兴建羊场时，尽量远离猪场、牛场；第二：控制传染源，严禁从患伪狂犬病的地区引进羔羊及种羊，加强对精液的管理；第三：加强饲养管理，提倡自繁自养，引种时严格检疫，提高羊群对该病的抵抗力；第四：加大羊场的卫生消毒力度、做好灭鼠工作，切断该病在易感动物间的传播。

另外，对gE蛋白氨基酸差异位点分析，该绵羊分离株与亚洲猪源伪狂犬病病毒变异株几乎完全一致，但又出现了新的氨基酸变异点：L49P，P160T，V406G，G445R。由于GenBank上没有羊源伪狂犬病的gE基因序列，这些氨基酸位点的变异是否与病毒的宿主特性、毒力等相关，有待进一步的研究。

［1］卫广森.兽医全攻略-羊病学［M］.北京：中国农业出版社，2002：116-119.

［2］赵云侠，付艳红，郭百超.绵羊伪狂犬病的诊治［J］.当代畜牧，2013，03：27.

［3］李峰，张文通，王玉茂，等.波尔山羊羔羊伪狂犬病的诊治［J］.黑龙江畜牧兽医，2013，08：96-97.

［4］张克山，刘永杰，孔汉金，等.绵羊伪狂犬病病毒的鉴定及序列分析［J］.中国兽医科学，2013，03：221-224.

［5］张文花，和国忠，和仕良，等.高海拔地区绵羊及牧羊犬伪狂犬病的防制［J］.云南畜牧兽医，2011，02：19.

［6］金宁一，钱军，陈溥言.中国畜牧兽医学会动物传染病学分会［C］.徐州：2013：427-428.

［7］赵鸿远，彭金美，安同庆，等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征［J］.中国预防兽医学报，2014，36（7）：506-509.

［8］袁庆志，吴裕祥，李亚香，等.伪狂犬病免疫的研究-伪狂犬病弱毒疫苗的研究［J］.家畜传染病，1983，5（1）：1-6.

［9］杨庆芳，宁官保.猪伪狂犬病的研究进展［J］.畜牧兽医科技信息，2010，7：15-18.

TheOccurrenceof Sheep Pseudorabies and Variation Analysis of theGlycoprotein E Geneof theVirus

ZHANG Zhen-dong1，WANG Guang-wen1，HU Dong-fang1，NIU Yu-juan1，ZHANG Min-xia1，LV Chuan-wei1，LV Lin1，ZHANG Qing-lin2，XIAO Yi-hong1，LIU Si-dang1
（1.Animal Science and Technology of Shandong Agricultural University，Tai’an 271000，China；2.Biology Department of Taishan Polytechnic，Tai’an 271000，China）

To diagnose a suspected sheep pseudorabies case，pathologic autopsy was performed and tissues of the sheep were collected for virus isolation and identification using PCR.PRV was amplified from the tissues and its infection was confirmed.In order to further understand the molecule characteristic of the gE gene，the 1740-bp DNA fragment of gE gene was amplified，cloned and sequenced.Phylogenetic analysis showed that the sheep PRV isolate shared 98.4%to 99.4%sequence identity with all kinds of isolates from Asia，and shared 97.0%to 97.2%and 97.2%to 97.3%sequence identity with Europe and American isolates，respectively.The alignment results revealed that the isolate had the same sequence features with two insertions of Asp at sites of 48 and 492 comparing with the PRVs isolated from the modern prevalent mutations.Besides，four new amino acid sites emerged，and they were L49P，P160T，V406G and G445R compared with the prevalent mutated strains of swine PR.This study provides an useful information for the molecular epidemiology，prevention and control of sheep PRV in China.

sheep pseudorabies virus；Jining；gE；isolation and identification；sequence variation

LIU Si-dang

S852.65+5

A

0529-6005（2016）04-0046-03

2014-12-19

山东省牛产业技术体系资助（SDAIT-12-011-04）

张振东（1990-），男，执业兽医师，硕士，主要从事动物临床病理学研究，E-mail：zhangzhend90@126.com

王广文（1989-），男，执业兽医师，硕士，主要从事动物临床病理学研究，E-mail：1126255119@qq.com

注：王广文与李振东对本文具有同等贡献

刘思当，E-mail：liusid@sdau.edu.cn