黄　凯，朱风华，宋明明，徐　丹，王　赫，张瑞星，朱连勤

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

腹腔注射不同剂量DON对肉鸡免疫功能及血液生化指标的影响

黄凯，朱风华，宋明明，徐丹，王赫，张瑞星，朱连勤

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

本试验对腹腔注射不同剂量的脱氧化雪腐镰刀菌烯醇（DON）对肉鸡的毒性作用进行了研究。将32只AA肉公鸡随机分为4组，每组8只。1组为对照组，腹腔注射生理盐水，2～4组为试验组，分别腹腔注射含10、50、100 μg/mL的DON生理盐水溶液1 mL。每天注射1次，试验期35 d。结果显示，DON中高剂量组IL-4、IL-6、IgA、IgM、ND和IBD抗体水平、GSH-Px活性、总抗氧化能力显著低于对照组（P＜0.05），各试验组谷丙转氨酶活性显著高于对照组（P＜0.05），DON高剂量组脾脏淋巴细胞转化率、外周血淋巴细胞转化率显著低于其他各组（P＜0.05）。由此可见DON对肉鸡具有明显的氧化损伤和免疫毒性，且呈剂量相关性。

DON；腹腔注射；肉鸡；氧化损伤；免疫功能

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是存在于粮食和饲料中的主要真菌毒素之一［1］。杜妮［2］在2013年检测动物配合饲料，发现DON检出率达98.02%、最高值为5 665.30 μg/kg、平均值为1 195.50 μg/kg，均高于猪配合饲料限量标准（1 000 μg/kg）。王金勇等［3］在2013年检测了猪禽饲料，发现猪饲料DON最高值为4 773 μg/kg、平均值为592 μg/kg；禽饲料最高值为2 838 μg/kg、平均值为616 μg/kg。DON在饲料中的污染状况引起了饲料和养殖业界的高度关注。许多研究证明，DON具有免疫毒性和氧化损伤作用。但是，关于DON对家禽毒性研究鲜有报道。本试验采用腹腔注射的攻毒方式，探讨DON对肉鸡的免疫毒性及氧化损伤，进一步阐释DON致肉鸡中毒的机理。

1　材料与方法

1.1试验动物与处理选32只1日龄健康AA肉鸡随机分为4组，1组为对照组，腹腔注射生理盐水1 mL；2、3、4组为试验组，分别腹腔注射含DON 10、50、100 μg/mL的生理盐水溶液1 mL，每天注射1次。试验期35 d。

1.2饲养管理饲喂全价颗粒料，自由采食和饮水。7日龄，接种新城疫Ⅳ系、传支H120二联冻干苗，双倍点眼滴鼻免疫；14日龄，接种传染性囊病疫苗，双倍饮水。21日龄，接种新城疫Ⅳ系疫苗，双倍饮水。

1.3试剂与药品DON纯品、ConA和MTT，购自美国Sigma公司；RPMI-1640，购自美国GIBCO公司；胎牛血浆，购自杭州四季青生物工程材料研究所；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6检测试剂盒、二甲基亚砜，均购自南京建成生物工程研究所。新城疫抗体（NDV-Ab）、传染性囊病抗体（IBDV-Ab）检测试剂盒，购自上海劲马生物科技有限公司。

1.4检测指标与方法

1.4.1血浆中免疫指标的测定对32只肉鸡进行心脏采血，肝素钠抗凝，3 000 r/min离心15 min，取上层血浆，用酶联免疫法检测血浆中IL-2、IL-4、IL-6、IgA、IgG、IgM、NDV-Ab、IBDV-Ab的含量。

1.4.2血浆中生化指标的测定用比色法检测血浆中T-AOC、GSH-Px、ALT、AST的活性。

1.4.3外周血、脾脏淋巴细胞转化率的测定每组随机取4只鸡，心脏无菌采血2 mL，肝素钠抗凝，取1 mL用Hank′s液1∶1稀释，用淋巴细胞分离液进行外周血淋巴细胞分离，分离的外周血淋巴细胞用PBS洗涤两次，最后用RPMI 1640完全培养液洗涤一次，重悬，计数，并用台盼蓝检测细胞活力大于95%，将外周血淋巴细胞的浓度调成2.0×106个/mL备用。接着无菌条件下，将鸡的脾脏取出，放入盛有PBS的培养皿内，用PBS轻轻清洗掉脾脏周围的血液残渣，剥离脾脏周围的结缔组织，将其放入200目筛网上，用镊子撕碎，用20 mL一次性注射器的内芯轻轻研磨、过滤，用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，分离的脾脏淋巴细胞用PBS洗涤两次，最后用RPMI 1640完全培养液洗涤一次，重悬，计数，并用台盼蓝检测细胞活力大于95%，将脾脏淋巴细胞的浓度调成2.0×106个/ mL。采用MTT法检测鸡外周血和脾脏淋巴细胞转化率。将淋巴细胞加入96孔细胞培养板，每孔100 μL，另设培养基空白对照组（无淋巴细胞，只含RPMI-1640和ConA），每孔加入10 μL 100 μg/ mL的ConA。设5个重复。培养72 h，培养终止前4 h，每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT 10 μL，培养至终止，每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO），吹打混匀，静置10 min，使细胞内结晶物完全溶解，用酶标仪测定OD490nm值。计算淋巴细胞转化率：

淋巴细胞转化率=（试验组OD值-空白对照组OD值）/空白对照组OD值

1.5数据统计分析试验数据采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和最小显著差异法（LSD）对各均值进行多重比较，结果用±SD表示。

2　结果

2.1注射不同剂量DON对肉鸡血浆细胞因子和抗体水平的影响腹腔注射含DON 10-100 μg/mL的生理盐水溶液组，肉鸡血浆IL-2、IL-6、IgA和IgM含量显著低于对照组（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL组，肉鸡血浆IL-4含量和NDV-Ab水平显著低于对照组和腹腔注射含DON 10 μg/mL组（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL组，IBD-Ab水平显著低于对照组（P＜0.05），见表1。

2.2注射不同剂量DON对血浆生化指标的影响

试验至42 d，腹腔注射含DON 50 μg/mL和100 μg/mL组，肉鸡血浆T-AOC水平显著低于对照组和腹腔注射含DON 10 μg/mL组（P＜0.05）。腹腔注射含DON 10-100 μg/mL组，肉鸡血浆GSH-Px活性显著低于对照组（P＜0.05），肉鸡血浆ALT水平显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表1　不同注射剂量DON对肉鸡血浆细胞因子和抗体水平的影响

表2　不同注射剂量DON对血液生化指标的影响单位：U/L

2.3注射不同剂量DON对肉鸡脾脏淋巴细胞转化率以及外周血淋巴细胞转化率的影响腹腔注射含DON 100 μg/mL组，肉鸡脾脏和外周血LTR显著低于其他各组（P＜0.05），其他各组差异不显著（P＞0.05），见表3。

表3　不同注射剂量DON对肉鸡淋巴细胞转化率的影响

3　讨论

本试验发现，给肉鸡连续35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理盐水溶液，NDV和IBDV抗体水平呈现下降的趋势；注射1 mL含DON 50 μg/mL和100 μg/mL的生理盐水溶液时，NDV抗体水平显著下降；注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理盐水溶液时，IBDV抗体水平显著下降。Harvey等［4］给肉鸡饲喂含DON 50 mg/kg的日粮，降低肉鸡血清NDV和IBDV抗体浓度。Dänicke等［5］报道，用主要含DON（含量分别为3.5、7.0、10.5 mg/kg和14.0 mg/kg）的小麦饲喂肉鸡，发现血清NDV抗体滴度明显降低，且呈明显的浓度依赖性。本试验还发现，给肉鸡连续35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理盐水溶液，显著降低血浆IgA和IgM含量。Warner等［6］通过鼠脾脏淋巴细胞体外试验也证明，培养基质中DON浓度在10 μg/mL～1 000 μg/mL时，能降低培养基质中IgA、IgG、IgM的含量。本试验还发现，注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理盐水溶液时，脾脏淋巴细胞和外周血淋巴细胞转化率显著降低。Ouyang等［7］研究显示，培养的CD4+T细胞在DON（50～500 μg/mL）作用下，低浓度DON（50 μg/mL和100 μg/mL）能延迟或损害细胞增殖，而高浓度下DON（250～500 μg/mL）能完全抑制细胞增殖。Harvey等［4］给肉鸡饲喂含DON 50 mg/kg的日粮，发现DON能够抑制促进淋巴细胞分裂的有丝分裂原的产生。Warner等［6］通过体外试验也证明，培养基质中DON浓度在10～1 000 μg/mL时，能抑制鼠脾脏淋巴细胞DNA、蛋白质的合成。给肉鸡连续35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理盐水溶液，显著降低肉鸡血浆IL-2、IL-4和IL-6含量。可以看出，呕吐毒素对肉鸡细胞免疫和体液免疫产生不利影响，染毒剂量越高越严重。

本试验发现，给肉鸡连续35 d腹腔注射1 mL含DON 50和100 μg/mL的生理盐水溶液，肉鸡血液总抗氧化能力显著降低，血浆GSH-Px活性显著下降，血浆AST和ALT活性显著升高。Kouadio等［8］用DON（5-40 μmol/L）处理Caco-2细胞24 h，发现DON可以阻断Caco-2细胞鞘磷脂代谢，导致脂质过氧化，改变细胞膜的结构而导致细胞死亡，使细胞MDA增加，细胞抗氧化能力下降。Chen等［9］试验结果显示，给仔猪连续6周饲喂含DON 1 mg/kg饲料，明显提高AST和ALT活性。由此可见，DON具有明显的氧化损伤作用并造成肝脏损害。

［1］Plattner R D，Maragos C M.Determination of deoxynivalenol and nivalenol in corn and wheat by liquid chromatography with electrospray mass spectrometry［J］.Journal of AOAC International，2003，86（1）：61-65.

［2］杜妮.2013年我国部分地区饲料及原料霉菌毒素污染调査报告［J］.今日养猪业，2014，3：48-52.

［3］王金勇，刘颖莉，关舒.2013年中国饲料和原料霉菌毒素检测报告［J］.国外畜牧学-猪与禽，2014，34（2）：49-51.

［4］Harvey R B，Huff W E，Elissalde M H，et al.Heamatologic and immunologic toxicity of deoxynivalenol（DON）-contaminated diets to growing chickens［J］.Bull Environ Contam and Toxicol，1991，46（3）：410-416.

［5］Dänicke S，Matthes S，Halle I，et al.Effects of graded levels of Fusarium toxin contaminated wheat and of a detoxifying agent in broiler diets on performance，nutrient digestibility and blood chemical parameters［J］.Poultry Science，2003，44（1）：113-126.

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TheEffect of Intraperitoneal Injection of Deoxynivalenol on Biochemical and ImmuneIndexes of Plasma in Broiler Chickens

HUANG Kai，ZHU Feng-hua，SONG Ming-ming，XU Dan，WANG He，ZHANG Rui-xing，ZHU Lian-qin
（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

This trial was conducted to determine the effect of intraperitoneal injection of the deoxynivalenol on broiler chickens.A total of 32 male broiler chicks were randomly divided into 4 treatments with 8 broiler chickens per treatment.Treatment one was the control group injected with normal saline.The broiler chickens in treatment two to four were intraperitoneally injected with 1 mL deoxynivalenol containing deoxynivalenol 10，50 and 100 μg/mL，respectively，once a day for 5 weeks.The results showed that the concentration of IL-4，IL-6，IgA and IgM，the antibody level of NDV and IBDV，the activity of GSH-Px，and the level of T-AOC in serum in the broiler chickens intraperitoneally injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 50 or 100 μg/mL were significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 10～100 μg/mL，the activity of AST in serum was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 100 μg/mL，LTR of spleen and peripheral blood was significantly lower than other treatments（P＜0.05）.In conclusion，the deoxynivalenol has significantoxidative damage and immunotoxicity to broilers in a dose-dependent manner.

Deoxynivalenol；Intraperitoneal injection；Broiler chicken；Oxidative stress；Immunity

ZHU Lian-qin

S858.31

A

0529-6005（2016）04-0033-03

2014-10-14

山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队项目（SDAIT-13-011-07）；青岛科技局项目（12-1-2-32-nsh）

黄凯（1988-），男，硕士，研究方向为动物营养代谢病与中毒病，E-mail：945044149@qq.com

朱连勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn