任颖超，黄　娟，单　虎

（青岛农业大学 山东省高校预防兽医学重点实验室，山东 青岛266109）

PRRSV变异株ORF5全基因的可溶性表达与重组蛋白的纯化

任颖超，黄娟，单虎

（青岛农业大学 山东省高校预防兽医学重点实验室，山东 青岛266109）

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变异株可溶性糖基化囊膜蛋白（GP5），从pMD18-T-ORF5（V）重组质粒中PCR扩增得到PRRSV变异株LX13（1）结构蛋白ORF5全基因编码区，并克隆至原核表达载体pCold TF DNA上，得到重组表达质粒pCold-TF-GP5（V），转化大肠埃希菌BL21中诱导表达，并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析。结果表明，目的基因插入位置和阅读框正确，成功表达的融合蛋白分子量约为75.2 ku，并以可溶性蛋白的形式存在，表达量约占菌体总蛋白含量的22.26%。该融合蛋白能与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应，说明重组蛋白具有反应原性。该可溶性重组蛋白的获得为研究PRRSV变异株GP5蛋白的抗原性奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；变异株；ORF5基因；可溶性原核表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）可引起妊娠母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状甚至死亡。该病在1987年首发于美国，并很快蔓延至世界各地。郭宝清等于1996年在国内首次分离到该病毒。之后，随着PRRSV的遗传和变异，我国在2006年暴发了以仔猪高死亡率为特征的高致病性蓝耳病［1］，使我国养猪业受到重创。

PRRSV的主要结构蛋白GP5是由ORF5编码的糖基化囊膜蛋白，变异性较强，具有诱导细胞凋亡的活性，并可能参与病毒入侵宿主细胞的过程［2］。GP5蛋白被认为是PRRSV免疫保护的主要蛋白［3］。高致病性PRRSV变异株和经典株在GP5蛋白基因上发生较大的变异，其核苷酸变异性在5%以上［4］，这种变异对其抗原性的影响还未见报道。

本研究采用一种高效原核表达载体pCold TF DNA获得高致病性PRRSV变异株重组GP5表达质粒，在E.coli BL21中获得可溶性表达产物，并对表达的重组融合蛋白进行定性分析，为进一步比较高致病性PRRSV变异株和经典株GP5蛋白抗原性差异奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与载体大肠埃希菌（E.coli）DH5α和BL21、质粒pCold TF DNA，购自TaKaRa公司，含PRRSV变异株LX13（1）株ORF5基因的质粒pMDl8-T-ORF5（V）由笔者构建、保存。

1.1.2试剂限制性内切酶（EcoR I、Kpn I），T4 DNA连接酶，HRP标记的抗His标签鼠单抗，购自北京康为世纪生物科技有限公司；His Trap HP亲和层析柱，购自GE Healthcare公司。

1.2方法

1.2.1重组原核表达载体pCold-TF-GP5（V）的构建及鉴定根据LX13（1）核苷酸序列，应用Primer5.0软件设计一对特异性引物，P1：5′-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3′；P2：5′-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3′，划线部分为EcoR I和Kpn I酶切位点。以pMDl8-T-ORF5（V）为模板进行PCR扩增，EcoR I和Kpn I双酶切PCR产物纯化后，连接至pCold TF DNA，并转化DH5α。鉴定后的阳性质粒由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.2TF-GP5（V）蛋白的诱导表达及可溶性分析将pCold-TF-GP5（V）转化BL21菌后，按1∶100比例接种于含有50 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃振荡，当培养液的D600nm值为0.4～0.5时，移至15℃放置30 min。添加IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，15℃条件下培养24 h。诱导菌体、诱导菌体超声波破碎后的上清和沉淀分别取样进行SDS-PAGE电泳。

1.2.3TF-GP5（V）蛋白的纯化及Western Blot鉴定将诱导的菌体经超声波破碎后离心，取上清经镍柱纯化。将表达产物湿转转至PVDF膜上，5%BSA中过夜封闭；使用HRP标记的抗His标签鼠单抗孵育后，置于DAB底物显色液中显色。

2　结果与分析

2.1重组原核表达载体pCold-TF-GP5（V）的构建及鉴定扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上出现与预期片段大小（618 bp）一致的条带（图1）。重组质粒经EcoR I、Kpn I双酶切，在5 769 bp（pCold TF DNA载体片段）和618 bp（目的片段）处出现条带；以重组质粒为模板进行PCR鉴定得到618 bp左右的片段（图2），均与预期相符。将测序正确的重组质粒命名为pCold-TF-GP5（V）。

2.2TF-GP5（V）蛋白的诱导表达及可溶性分析

图1　PCR扩增ORF5基因

图2　重组质粒pCold-TF-GP5（V）的鉴定

pCold-TF-GP5（V）重组转化菌经IPTG于15℃诱导24 h后，在75.2 ku附近出现一蛋白条带，与预期大小一致。经超声波破碎后发现，重组蛋白主要存在上清中，沉淀中几乎没有，为可溶性表达。而空载体pCold TF DNA转化菌经诱导可表达52 ku的TF蛋白（图3）。

图3　SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达

2.3TF-GP5（V）蛋白的纯化及Western Blot分析

经纯化获得较纯的75.2 ku重组蛋白（图4）。Western Blot结果显示，融合蛋白在75.2 ku大小附近出现一条清晰的反应条带（图5），表明融合蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应，具有良好的反应原性。

图4　重组蛋白的纯化

图5　Western Blot鉴定GP5融合蛋白的反应原性

3　讨论

在我国PRRSV尤其是高致病性PRRSV变异株始终是严重威胁养猪业的最重要病原之一。免疫接种是目前防制PRRS的主要措施，但PRRS灭活疫苗保护率低，活疫苗不能免疫妊娠母猪和种猪，不利于该病的彻底防制［5］。PRRSV的高变异性也给疫苗免疫带来新的挑战。GP5蛋白是PRRSV的重要结构蛋白之一，能起到参与体液免疫和细胞免疫的作用，并具有较高的免疫原性和中和活性，是研究PRRSV免疫保护的热点蛋白［6］。因此，研究PRRSV高致病性变异株和经典株GP5蛋白基因的变异性和蛋白的抗原性在疫苗制备中意义重大。

GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋白，含有高度保守的N-糖基化位点和高疏水区的信号肽序列，因而在大肠埃希菌等表达系统中表达一直不够理想，很难表达出完整的GP5蛋白［7］。以往的研究中，多通过去除基因N端的信号肽序列或跨膜区或通过密码子优化等手段以期获得GP5蛋白的表达，尽管有些能获得高效表达，但也多以包涵体形式存在［8-9］。后期还需蛋白质复性才能获得可溶性蛋白，而复性过程十分复杂，且效率往往与特定蛋白质的性质有关，选择何种方法也需要反复试验，操作繁琐［10］。

pCold TF DNA带有cspA（冷休克蛋白A）启动子及相关元件，使得菌体在低温15℃环境下培养时，目的蛋白质的产量得到了提高，此外，由于pCold TF DNA带有可溶性标签Trigger Factor（TF），能提高目的蛋白质的可溶性［11］。因此，本研究选用pCold TF DNA来表达融合蛋白，SDS-PAGE和Western Blot分析表明，在大肠杆菌BL21中完整的PRRSV GP5蛋白获得了高效可溶性表达，且具有良好的反应原性。为下一步研究PRRSV高致病性变异株GP5蛋白的免疫原性及与经典株GP5蛋白的交叉反应性奠定基础。

［1］童光志，周艳君，郝晓芳，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析［J］.中国预防兽医学报，2007，29（5）：323-326.

［2］Delputte P L，Vanderheijden N，Nauwynck H J，et al.Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages［J］.J Virol，2002，76（9）：4312-4320.

［3］Zheng Q S，Chen D S，Li P，et al.Co-expressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus Ankara（rMVA）-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）［J］.Virus Genes，2007，35：585-595.

［4］安同庆，田志军，肖燕，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析［J］.中国预防兽医学报，2008，30（11）：851-855.

［5］冷超粮.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究［J］.中国预防兽医学报，2011，33（4）：297-300.

［6］李欣贤，张晓丹，刘晶晶，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析［J］.中国畜牧兽医，2014，41（4）：89-94.

［7］尹国友，孙婕，黄保续.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达［J］.动物医学进展，2009，30（12）：63-66.

［8］刘岳，肖一红，崔然，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白分段表达及其生物学功能的鉴定［J］.中国预防兽医学报，2011，33（4）：257-260.

［9］孙文超，任静强，温树波，等.应用不同表达载体表达欧洲型PRRSV ORF5蛋白的研究［J］.中国病原生物学杂志，2013，8（11）：961-965.

［10］谷红，杨汉春，郭鑫，等.PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化［J］.畜牧兽医学报，2004，35（1）：64-69.

［11］杨李，周鹰，王运刚，等.粉尘螨变应原第1组分原核表达质粒pCold-TF-Derf1构建及鉴定［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2012，23（4）：289-291.

SolubleProkaryotic Expression of ORF5 Geneof PRRSV Variant and Purification of Recombinant Protein

REN Ying-chao，HUANG Juan，SHAN Hu
（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

The coding region of ORF5 gene from PRRSV variant was successfully amplified from pMD18-T-ORF5（V）by PCR，and was cloned into the prokaryotic expression vector pCold TF.The recombinant plasmid pCold-TF-GP5（V）was transformed into E.coli BL21 and the induced protein was confired by SDS-PAGE and Western blot.The results showed the target gene was inserted into the exact location and the reading frame was correct.An 75.2 ku soluble protein was successfully induced with a content of 22.26%of total bacterial protein.The recombinant protein showed good reaction with the His-tag monoclonal antibody. Our results contribute to the antigenicity study of glycosylated envelope protein 5（GP5）from PRRSV variant.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；Variant；ORF5 gene；Soluble prokaryotic expression

HUANG Juan

S852.65+1

A

0529-6005（2016）04-0030-03

2014-11-28

国家科技基础性工作专项（2012FY111000）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队建设；青岛农业大学高层次人才科研基金（6630719）

任颖超（1989-），女，硕士，研究方向为兽医传染病学与生物制品，E-mail：sdzbryc@163.com

，黄娟，E-mail：happyhj888@163.com