马士博，谭　飞，姜艳平，乔薪瑗，崔　文，唐丽杰，刘　敏，李一经

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

猪轮状病毒HeBei-12株在MA-104细胞上最适繁殖时间的摸索

马士博，谭飞，姜艳平，乔薪瑗，崔文，唐丽杰，刘敏，李一经

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

本试验将HeBei-12株猪轮状病毒在MA-104细胞上培养，通过对病毒的细胞培养物进行核酸提取及RT-PCR检测证明，该病毒可以很好的适应细胞。为获得最佳的病毒培养量，本试验分别从间接免疫荧光，增殖动力学曲线以及病毒感染细胞后的超薄切片电镜对病毒的繁殖周期做了初步研究。结果表明，HeBei-12株猪轮状病毒在感染MA-104细胞时，病毒粒子是随着时间的变化而变化的，当病毒接种20 h时即可在细胞质中观察到病毒粒子。当病毒感染细胞64 h时，滴度达到最大值4.8 logTCID50/mL，此后滴度逐渐下降。本试验对猪轮状病毒地方流行株HeBei-12株在MA-104细胞上的最佳繁殖时间进行摸索，为进一步研究其生物学特性和疫苗研制奠定了基础。

猪轮状病毒HeBei-12株；繁殖时间；恒河猴胎肾细胞

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是导致动物腹泻的重要病原之一，给畜牧业造成严重的经济损失。其发生不受卫生状况影响，由于目前尚无特效药物治疗，疫苗接种仍是最有力的预防和控制措施。因此选择理想毒株以及摸索最佳病毒繁殖量在研制猪轮状病毒疫苗是至关重要的。本研究从不同角度分析了HeBei-12株猪轮状病毒在MA-104细胞上的繁殖趋势，以期为进一步研究其生物学特性和疫苗的研发提供实验数据和理论基础。

1　材料与方法

1.1病料及细胞猪腹泻病料（2012年采自河北省某猪场）经本实验室检验为猪轮状病毒阳性，命名为HeBei-12株，于-80℃冷藏备用。JL-94株轮状病毒为本实验室保存。MA-104细胞（恒河猴胎肾传代细胞）为本实验室保存。

1.2主要试剂DMEM、胎牛血清为HyClone公司产品；小量病毒RNA抽提试剂盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0），购自上海华舜生物技术有限公司；DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；FITC标记的山羊抗鼠IgG，购自Sigma公司；猪轮状病毒阳性血清为本实验室制备。

1.3引物设计与合成参考GenBank中porcine RV（L29186.1）参考株基因序列，利用软件Primer 5.0设计合成特异性套式PCR引物，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列参见表1。

表1　套式PCR引物序列

1.4方法

1.4.1病料处理及细胞接种将粪便样品移入EP管中，经研磨器充分研磨后，按1∶1比例加入PBS缓冲溶液，将样品悬起，反复冻融3次，4 000 r/min（4℃）离心15 min，收集上清。经RT-PCR检测为轮状病毒阳性且不混合感染其他腹泻病毒。将腹泻病料用无血清的DMEM进行1∶10稀释，反复冻融3次，12 000 r/min离心8 min，取上清用0.22 μm滤器过滤后，接种于MA-104细胞，用含10%FBS（新生牛血清）的DMEM培养基进行传代培养。病毒接种前，用30 μg/mL胰酶在37℃处理60 min，待细胞长成致密单层后，按0.05 MOI接种HeBei-12株病毒，待CPE达90%时收获病毒液，按此方法将病毒连续传代，观察细胞病变［1］。

1.4.2RT-PCR检测取病毒在MA-104上得第8代细胞培养物，反复冻融3次，10 000 r/min离心5 min，取上清5 000 r/min离心15 min。采用小量病毒RNA抽提试剂盒提取病毒基因组RNA，然后在42℃条件下反转录获得cDNA。采用针对流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒及轮状病毒的引物对其进行nest-PCR检测［2］。反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环数30个，72℃终延伸10 min，4℃终止反应。所得的PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.4.3间接免疫荧光检测取第8代轮状病毒核酸阳性的细胞培养物接种于长满单层的MA-104细胞，分别在第36、54、70 h和100 h时用甲醇固定（4℃，10 min），Triton X-100作用10 min，3% BSA 37℃封闭30 min，依次加入鼠抗轮状病毒JL-94株全病毒多克隆抗体（1∶200稀释）和FITC标记的山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀释），分别于37℃条件下作用60 min，PBS清洗后分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察结果［3］。

1.4.4增殖动力学曲线的绘制取第8代轮状病毒核酸阳性的细胞培养物接种于长满单层的MA-104细胞，每10 h测其半数组织培养感染剂量（TCID50），比较病毒滴度的变化情况，具体方法如下：将10倍系列稀释的病毒接种于长成单层细胞的96孔板中，每个稀释度设3个重复，并设细胞对照和未稀释病毒对照。37℃，5%CO2条件下培养5 d，每天观察细胞病变。按Reed-Muench公式计算病毒的感染性滴度［4］。

1.4.5电镜检测将HeBei-12株轮状病毒接种于长满单层的MA-104细胞，每10 h取病毒的细胞培养物（90 mL），离心后用1 mL DMEM悬起。4%戊二醛前固定，再用1%OsO4后固定，丙酮逐级脱水，Epon812环氧树脂包埋，烘干10 d左右，对样品进行超薄切片后正染色，最后置于透射电子显微镜下观察［4-5］。

2　结果

图1　轮状病毒HeBei-12株感染MA-104细胞70 h时的CPE （40×）

2.1CPE观察猪状病毒HeBei-12株感染MA-104细胞70 h时，可观察到明显的CPE，表现为细胞膜融合，细胞核固缩、空泡化，感染细胞大片脱落，如图1B。

2.2RT-PCR检测结果通过对病毒的细胞培养物RNA的提取，并进行RT-PCR检测，经核酸检测得到大小约274 bp的目的条带，与预期结果符合。结果表明，HeBei-12株轮状病毒已适应MA-104细胞。结果见图2。

图2　RT-PCR检测结果

2.3间接免疫荧光检测对轮状病毒核酸阳性者在MA-104细胞上接种。为获得病毒在细胞上的最佳繁殖量，本试验对收毒时间进行初步摸索，图3为HeBei-12株病毒在MA-104细胞上繁殖36、54、70 h和100 h时的间接免疫荧光结果（如图3）。结果表明，当病毒感染36 h时，细胞保持着完整的形态，仅呈现出轻微的荧光（如图3A和3E）。54 h时细胞开始发生轻微病变，细胞质染色加深且特异性荧光更加明显（如图3B和3F）。70 h时呈现明显的CPE，有的细胞完全被荧光颗粒所充满，有的细胞已经破裂，仅可以看到非特异性的细胞轮廓（如图3C和3G）。100 h时大部分细胞破裂，丧失细胞形态（如图3D和3H）。由此，初步确定病毒在MA-104细胞上培养最适培养时间为60～70 h。

图3　间接免疫荧光结果

2.4病毒的动力学增殖曲线将HeBei-12病毒接种于MA-104细胞，测定其动力学增殖曲线，结果见图4。当病毒感染64 h时，在MA-104细胞中滴度达到最大值4.8 log TCID50/mL。此后滴度逐渐下降。因此，确定病毒感染MA-104细胞的最适收毒时间为64 h。

图4　病毒的增殖动力学曲线

2.5超薄切片电镜将HeBei-12株猪轮状病毒接种于MA-104细胞，在不同时间对病毒量进行监测。结果如图5所示，当病毒感染细胞20 h时，细胞保持完整且良好的形态，未见有病毒粒子。30 h时视野中观察到了典型的病毒粒子，弥散的存在于细胞质中。40 h时细胞质中的病毒粒子增多，细胞发生轻微的病变。50 h时病毒粒子继续增殖，病变程度加深，细胞折光度发生了明显的变化。60 h时病毒粒子充满了整个细胞质中，细胞核明显萎缩。70 h时病毒粒子开始减少，细胞核空泡化，各个细胞器均发生了明显的病变且失去了完整的细胞构架。80 h时伴随着病毒粒子的释放细胞质中的病毒进一步减少。病毒繁殖90 h后，细胞形态已基本丧失。

图5　超薄切片

3　讨论

轮状病毒是引起幼龄动物腹泻的重要病原之一。该病发生于世界各地，给畜牧业带来很大的经济损失。目前尚无特效药物来治疗该病［6-7］，主要仍以预防为主，而病毒在细胞上的分离培养和提高滴度是疫苗研制的关键因素。

本试验对从河北省收集的猪腹泻粪便样品（已经验证了其为轮状病毒感染，且无其他腹泻病毒的混合感染），命名为HeBei-12株。对该病毒在MA-104细胞上进行驯化培养。结果显示，该毒株在MA-104细胞上可出现典型的CPE，且随着传代次数增加，出现CPE的时间缩短，细胞病变程度也随之加剧。证明病毒可很好的适应细胞。

收毒时间是获得高滴度病毒的关键因素［8］，一方面病毒在细胞中有其各自的繁殖周期，另一方面从细胞中释放到培养液中的病毒并不能长时间的耐受37℃的条件。所以，当各方面因素达到平衡时获得病毒的最高滴度尤为重要。本试验分别从间接免疫荧光试验，增殖动力学曲线以及病毒感染细胞后的超薄切片电镜观察进行测定，以确定最佳收毒时间。结果显示，当病毒感染64 h时，病毒滴度可达到最大值4.8logTCID50/ mL。随着时间的推移滴度逐渐呈现下降趋势，因此确定病毒在MA-104细胞中培养的最佳收毒时间为64 h。

本试验证明了HeBei-12分离株对细胞具有良好的适应性，并对其在细胞中的繁殖情况进行摸索。为进一步研究其生物学特性和疫苗制备奠定了基础。

［1］库旭钢，张坤，刘羽茜，等.猪A群轮状病毒的分离与鉴定［J］.畜牧兽医学报，2012，42（2）：275-281.

［2］邓俊花，单虎.轮状病毒套式PCR方法的建立［J］.黑龙江畜牧兽医，2007，12:89-90.

［3］尹兴晓，文喻玲，赵庆欢，等.轮状病毒Vp6蛋白的免疫荧光检测［J］.中国生物制品学杂志，2008，21（5）：434-437.

［4］林杰，窦强，刘溯，等.轮状病毒LLR株在两种不同细胞中病毒滴度的比较［J］.中国新药杂志，2013，22（6）：643-646.

［5］王振玲，章丽娇，段跃强，等.猪轮状病毒的分离与电镜观察［J］.畜牧与兽医，2014，46（1）：77-80.

［6］陈元坤，周小平，周联.猪轮状病毒腹泻病的诊断方法研究［J］.四川畜牧兽医，2011，4：29-33.

［7］陈晓春，吴华伟，张广川，等.猪轮状病毒的分离与鉴定［J］.中国兽药杂志，2013，47（9）：4-8.

［8］Fang，Zhizheng.Rotavirus and vaccine in China.第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编，银川：2011，8.

Gropefor optimal proliferation timeof porcinerotavirusHeBei-12 strain in MA-104 cell line

MA Shi-bo，TAN Fei，JIANG Yan-ping，QIAO Xin-yuan，CUI Wen，TANG Li-jie，LIU Min，LI Yi-jing
（Department of Preventive Veterinary，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In this study，we showed that rotavirus HeBei-12 strain could grow well on MA-104 cell demonstrated by RT-PCR. Virus propagation was analyzed by immuno-fluorescence，proliferation kinetics，and electron microscope detection，and the haresting time was also optimized.The results showed that the virus particles constantly changed with time.The highest value of 4.8logTCID50/mL was detected at 62 h before the titers decreased gradually.Determination for optimal proliferation time would make a contribution to molecular biology study and vaccine development on porcine rotavirus.

Porcine rotavirus HeBei-12 strain；proliferation；MA-104 cell line

LI Yi-jing

S852.65+9.4

A

0529-6005（2016）04-0026-04

2014-11-04

“十二五”农村领域国家科技计划课题（2012AA10-1304-3）

马士博（1989-），女，硕士，研究方向为动物微生物与免疫，E-mail：mashibo8904@126.com

李一经，E-mail：yijingli@163.com