吴高峰，黄占旺*，刘宛玲，牛丽亚，王素贞，黄永平

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045）

纳豆冻干粉对抗生素介导小鼠免疫调节作用及细胞因子分泌的影响

吴高峰，黄占旺*，刘宛玲，牛丽亚，王素贞，黄永平

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045）

本实验旨在探究纳豆冻干粉（natto lyophilized powder，NLP）对昆明小鼠免疫功能及其细胞因子分泌的影响。选取体质健康昆明小鼠128 只，随机分为8 组：空白对照组（C组）、调节组（R0组和RN1、RN2、RN3组）4 组、预防组（P0、PN组）2 组、模型组（M组）。除C组外，其他各组灌胃3 d抗生素溶液，之后R0组灌胃生理盐水，RN1～RN3组灌胃不同剂量的NLP溶液；预防组每天继续灌胃抗生素溶液，8 h后P0、PN组分别灌胃生理盐水和NLP溶液；M组灌胃抗生素溶液。30 d后测定免疫指标及其细胞因子分泌量的变化情况。结果表明：与M组相比，低剂量的NLP能够极显著增加小鼠的脾脏指数和胸腺指数（P＜0.01），RN1、RN2、RN3组小鼠血清中白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的分泌量极显著增加（P＜0.01），同时，RN1、RN2、RN3组均能够极显著增加小鼠血清中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活力（P＜0.01），RN1、RN3组小鼠血清中白蛋白、球蛋白的含量和二者比值（白球比）及NO水平显著或极显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。C组、调节组、预防组小鼠的血清溶血素水平较对照组均极显著升高（P＜0.01）。RN1、RN2、RN3、PN组较M组均能够极显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用（P＜0.01）。与C组相比，RN1、RN2、RN3组小鼠的半数溶血值显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。RN3和PN组可极显著增加巨噬细胞吞噬百分率、鸡红细胞的吞噬数（P＜0.01）。结果表明NLP具有免疫增强作用和增加细胞因子分泌的作用。

纳豆冻干粉；抗生素；免疫调节作用

免疫是机体必需的一种生理功能，它包括特异性免疫和非特异性免疫。免疫即机体通过识别自身与非己的物质，从而产生免疫应答，清除抗原性异物，维持机体正常功能［1］。免疫系统是人体的生命防线，它由自身免疫系统和特异性免疫系统组成，它能够对机体进行免疫监视、防御和调控［2］，由免疫器官、免疫细胞以及免疫因子组成。

目前我国抗生素滥用现象非常严重，中国的抗生素使用率超过七成，是欧美国家的两倍多。而抗生素能够通过抑制机体中微生物的生长或者杀死微生物使得机体菌群失调，从而引起机体消化系统的溃败，激起机体的免疫反应［3］。研究表明，氨苄青霉素能够降低中性白细胞（具有趋化、吞噬、杀菌作用）介导的致病菌杀灭功能［4］和增加血液中嗜碱性粒细胞（能够促发过敏反应）的释放［5］。

纳豆是日本传统的健康发酵产品［6］。纳豆冻干粉（lyophilized natto powder，NLP）是利用纳豆菌发酵大豆制成纳豆，然后添加脱脂奶粉作为冻干保护剂冻干后粉碎制成的，其制作方法简便、适宜工业化生产，且活菌数高、贮存方便。关于纳豆及其产品对免疫的影响已有一些研究报道：张静等［7］研究发现纳豆片具有增强小鼠免疫功能的作用；方少琳［8］和彭亮［9］等研究发现纳豆冻干粉能提高小鼠免疫功能；沈柱英等［10］研究发现纳豆菌糖肽对小鼠有免疫调节作用；由于抗生素滥用的现象越来越严重［11］，且抗生素的摄入抑制了人类免疫系统的正常功能［12］，而纳豆冻干粉对于免疫功能的调节效果明显，因此，本研究考察纳豆冻干粉对抗生素介导小鼠的免疫调节作用，以期进一步研究纳豆冻干粉对动物肠道菌群的调节作用和对免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

纳豆菌BN-1，江西农业大学重点实验室微生物实验室保藏；纳豆，自制。纳豆冻干粉（NLP）由纳豆添加脱脂奶粉作为冻干保护剂真空冷冻干燥制成，活菌数为1×1011CFU/g。

SPF级雌性昆明小鼠，体质量18～22 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

盐酸林可霉素、氨苄青霉素、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA）、豚鼠血清、绵羊红细胞、文齐氏试剂、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Hank's液、RPMI-1640培养基 北京Solarbio公司；头孢唑啉钠 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；胎牛血清 北京全式金生物技术有限公司；小鼠血清白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒武汉优尔生生物科技有限公司；NO、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

UV-5200PC型紫外-可见分光光度计 上海元析仪器股份有限公司；Scientz-10N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan MK3酶标仪、3121型CO2培养箱 美国Thermo Labsystems公司；XD-202倒置显微镜 南京江南永新光学有限公司；恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；TGL-20000-cR高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及其处理

NLP的有效活菌数为0.5×1010～1.0×1011CFU/g，将NLP配制成10、100、400 mg/mL的溶液，用于小鼠灌胃实验。雌性昆明小鼠128 只，体质量18～22 g，在SPF级环境中（光照比50%、相对湿度50%、室温24～26 ℃、全新风单向流动）适应性饲养5 d后，随机分为8 组，每组16 只（每组分为两批，组间体质量差异≤0.5 g）：空白对照组（C组）、调节组（R0组和RN1、RN2、RN3组）4 组、预防组（P0、PN组）2 组、模型组（M组）。C组灌胃生理盐水；其余组灌胃抗生素溶液3 d（盐酸林可霉素、头孢唑林钠及氨苄青霉素的混合液，3 种抗生素质量浓度均为100 mg/mL）建模后，R0组灌胃生理盐水，RN1～RN3组分别灌胃低、中、高（109、1010、1011CFU/g）剂量的NLP；预防组每天继续灌胃抗生素溶液8 h后，P0组灌胃生理盐水，PN灌胃中剂量的NLP（1010CFU/g）；M组继续灌胃抗生素溶液。实验期为30 d，灌胃量为0.5 mL/只。将其中一批用于血清溶血素实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，另一批进行免疫器官指数、脾淋巴细胞转化实验和细胞因子的测定。

1.3.2 免疫力增强实验

1.3.2.1 免疫器官指数测定

小鼠建模后连续灌胃30 d并称体质量，氯仿麻醉解剖，心室穿透取血1 mL，4 000 r/min离心10 min，分离血清并分装，-80 ℃冻存。无菌条件下取小鼠胸腺和脾脏，及时称质量。免疫器官质量与体质量的比即为免疫器官指数。

1.3.2.2 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验

建模30 d后，无菌条件下取小鼠脾脏，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗两遍并研磨充分。取滤过液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，Hank's液洗2～3 遍。离心取沉淀，RPMI-1640培养基重悬，台盼蓝染色计数活细胞，活细胞比例不得低于95%，调整细胞浓度至3×106个/mL。于96 孔板内每孔加入90 μL细胞悬液和10 μL ConA溶液（终质量浓度为5 mg/mL），置5% CO2培养箱中37 ℃培养68 h取出，每孔加入10 μL终质量浓度为5 mg/mL的MTT。继续培养4 h取出，吸弃上清液90 μL，每孔加入100 μL DMSO，待结晶紫溶解后，用酶标仪在570 nm波长处检测光密度（OD570nm）值。

1.3.2.3 小鼠溶血素水平的测定

建模26 d后，每组取4 只小鼠腹腔注射0.2 mL体积分数2%的绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）进行免疫，4 d后依照1.3.2.1节方法取血清。用生理盐水将血清稀释200 倍，取1 mL置于试管内，依次加入体积分数10%的SRBC 0.5 mL、豚鼠血清1 mL（豚鼠血清提前用PBS按照体积比1∶8稀释）。另设置一不加血清的对照管（以PBS代替血清）。37 ℃恒温水浴反应20 min，冰浴终止反应，2 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，加入文齐氏试剂3 mL。同时另取一支试管测定半数溶血时的光密度值，加体积分数10%的SRBC 0.25 mL，加文齐氏试剂至4 mL，充分混匀。将加文齐氏试剂的试管放置10 min后，于540 nm波长处以对照管作为空白，分别测定各管的OD540nm值。依照公式（1）计算半数溶血值（HC50）。

1.3.2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）

建模30 d后，每组取4 只小鼠腹腔注射20%的鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min，脱颈椎处死，仰位固定后，腹腔注射2 mL生理盐水，转动鼠板1 min，吸出2 mL腹腔洗液，平均分滴于6 孔板两个孔内，编号后置于CO2培养箱中37 ℃温育30 min，加入2 mL无菌生理盐水漂洗2 次，以除去未贴壁的细胞。晾干后，加入1 mL丙酮-甲醇（1∶1，V/V）溶液固定2 min，加入1～1.5 mL Giemsa工作液染色3 min，加入4 mL蒸馏水漂洗2 次，晾干。在400 倍倒置显微镜下计数巨噬细胞，每个孔计数100 个，按照下式（2）、（3）计算吞噬百分率和吞噬指数。1.3.3 血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、iNOS、NO分泌量的检测

按照1.3.2.1节方法制备血清，采用ELISA试剂盒测定血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ含量；以NOS试剂盒测定iNOS活力，酶活力单位（U）定义为每毫升血清每分钟产生1 nmol NO；采用Griess法测定NO含量，严格按照试剂盒的操作规范进行。

1.3.4 小鼠生长性能及其血清中白蛋白、球蛋白含量和二者比值（白球比）的测定

记录各组小鼠建模前、建模后、灌药后15 d、灌药后30 d、停灌后15 d的体质量，对应的4 个时间段分别记为建模期、灌胃前期、灌胃后期、停灌期，计算每个时间段的体质量增加比（与前一阶段的体质量相比）。依照1.3.2.1节方法取血清，进行白蛋白和血清总蛋白含量的测定。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 NLP对抗生素介导小鼠免疫调节作用的影响

2.1.1 NLP对抗生素介导小鼠免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺能够产生T淋巴细胞和分泌胸腺激素及激素类物质，具有内分泌机能［13］，脾脏是哺乳动物最大的淋巴器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫［14］和体液免疫的中心。NLP中含有大量的纳豆芽孢杆菌菌体，而胞壁糖、肽聚糖、糖蛋白［15］等菌体成分可作为抗原刺激免疫器官。由表1可知，RN3组小鼠的脾脏指数明显高于R0组。与M组相比，除R0组和PN组外，其他组小鼠的脾脏指数均显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与M组相比，各组小鼠的胸腺指数均显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。这说明抗生素的介导使小鼠的免疫器官指数下降，而NLP能够对其进行调节和恢复，提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数，具有很好的免疫调节作用。

2.1.2 NLP对抗生素介导小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响

淋巴细胞是特异性免疫的功能性细胞，它能释放抗体，对外来的抗原进行有效抵御。如图1所示，C组、RN1～RN3组、P0组和PN组小鼠的脾淋巴细胞转化因子水平均极显著高于M组（P＜0.01），而R0组小鼠的脾淋巴细胞转化因子水平显著高于M组（P＜0.05），说明NLP有助于提高小鼠脾淋巴细胞转化因子水平，有效调节或预防小鼠免疫低下水平。使用抗生素建模后，小鼠的抵抗力大幅度下降，当灌胃NLP后，小鼠脾淋巴细胞的分泌功能逐渐增强，RN1～RN3组小鼠的脾淋巴细胞转化因子水平均高于R0组，且均极显著高于M组，说明NLP能够调节小鼠脾淋巴细胞的分泌转化，且效果明显优于灌胃生理盐水（R0组）对脾淋巴细胞转化的调节。以上结果说明NLP对抗生素介导小鼠的脾淋巴细胞转化作用影响显著。

2.1.3 NLP对抗生素介导小鼠血清溶血素水平的影响

用SRBC免疫后，小鼠血清出现溶血素（SRBC抗体），在补体豚鼠血清的作用下，发生溶血反应，释放血红蛋白，可根据血红蛋白确定血清溶血素的含量，采用HC50反映小鼠机体的免疫功能状态。由图2可知，对照组（N组）小鼠的HC50均极显著低于其余各组（P＜0.01），RN1～RN3组小鼠的HC50均显著或极显著高于C组（P＜0.05或P＜0.01），且明显高于R0组，说明NLP对抗生素介导小鼠有促进免疫调节作用。

2.1.4 NLP对抗生素介导小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响

巨噬细胞能够固定细胞或游离细胞残片，吞噬消化病原体，并激活其他免疫细胞作用病原体，清除体内的衰老或凋亡的细胞，以及免疫复合物和病原体等抗原性异物［16］。体内腹腔巨噬细胞能够吞噬外来抗原鸡红细胞，从而可以判断巨噬细胞吞噬功能。由图3A、B可知，与M组相比，吞噬指数与NLP的剂量成正比，吞噬百分率与NLP的剂量成反比，表明灌胃NLP后，小鼠腹腔中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数下降，被吞噬的鸡红细胞数增加。由图3C、D可知，被吞噬的鸡红细胞形态类似空泡且边缘较整齐，细胞核隐约可见。与P0组相比，RN3组和PN组均能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和提高巨噬细胞的吞噬百分率，RN1～RN3组和PN组能够明显增加鸡红细胞的吞噬指数。以上结果说明NLP具有很强的吞噬能力，能够有效预防抗生素介导小鼠免疫能力低下的状态。根据动物免疫检验方法［17］，以上结果表明NLP具有免疫增强作用。

2.2 NLP对抗生素介导小鼠细胞因子分泌功能的影响

细胞因子是介导抗体免疫应答和炎症反应的物质，TNF-α是由巨噬细胞产生的能杀伤肿瘤细胞和促进B淋巴细胞增生的细胞［18］。IL-10具有很强抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-γ及促炎因子的产生和释放［19］。IFN-γ在效应细胞内可以通过多种信号转导途径发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。这些细胞因子之间的交互作用能诱导其他相关基因表达，进而介导一系列细胞效应，如提高巨噬细胞的吞噬作用、加强T细胞的特异性细胞毒性作用等［20］。

由表2可知，与C组相比，抗生素（M组）能极显著降低小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的水平（P＜0.01），调节组小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的含量极显著高于M组（P＜0.01）。与M组相比，调节组小鼠血清中IL-2、IL-10的释放量极显著增加（P＜0.01）。与M组相比，PN组能极显著增加小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的释放量（P＜0.01），且较P0组也可明显增加TNF-α的释放，调节TNF-α水平到正常水平。RN3组小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的水平显著或极显著低于C组（P＜0.05或P＜0.01），PN组IL-10的分泌量极显著低于C组（P＜0.01），且低于P0组。NLP能够通过调节IL-10的分泌，间接调节小鼠免疫能力低下的症状。以上结果表明NLP能有效预防小鼠的免疫能力低下，恢复细胞因子的分泌，进而提高小鼠免疫功能。

NOS能够催化L-精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，通过测定光密度值即可计算出NOS活力。NOS可通过IFN-γ、TNF-α和脂多糖等刺激激活，生成高水平的NO，而多功能分子NO对NLRP3炎性体介导的免疫应答起负调控作用［21］。Griess法运用NO在酸性条件下能够与重氮盐磺胺产生重氮反应，然后与萘基乙烯基二胺发生偶合反应，发生颜色变化且与NO含量成正比的原理来检测NO水平。各组的iNOS的活力均极显著高于M组（P＜0.01），而各组间无差异（P＞0.05）。RN2组和RN3组的NO水平极显著高于M组（P＜0.01），RN3组的NO水平极显著高于C组（P＜0.01），以上结果说明NLP能够有效调控NO的释放进而调节免疫。

2.3 NLP对抗生素介导小鼠生长性能的影响

由表3可知，M组小鼠体质量增加比在建模期、灌胃前期、灌胃后期均极显著高于C组、调节组、预防组（P＜0.01），M组小鼠在停灌期的体质量负增长比也是最高的，这与Kim等［22］研究结果基本一致。建模期调节组和预防组由于灌胃抗生素溶液，导致小鼠肠道内微生物大量死亡、肠道功能下降，小鼠体质量不断增加；灌胃前期调节组小鼠的体质量增加比呈现负增长，说明NLP能够有效调节小鼠肠道菌群失调状态，从而部分恢复小鼠肠道功能；灌胃后期，PN组小鼠体质量增加比呈负增长，说明NLP能够通过恢复小鼠肠道正常功能而预防肠道菌群失调的状态；停灌期由于NLP中的菌群继续在小鼠肠道内繁殖，有助于恢复小鼠肠道正常消化功能，小鼠体质量减轻。在抗生素介导后，小鼠肠道由于益生菌的死亡，营养物质不能及时被消化，小鼠肠道粪便积留，进而影响小鼠肠道上皮细胞的免疫作用。

血清白蛋白和球蛋白是血清蛋白质的一部分，它们能抵抗抗原产生免疫反应来保护机体，白球比的变化反映机体免疫力的强弱。免疫功能抑制或者降低会造成血清球蛋白降低，而白蛋白的降低会影响免疫力。由表3可知，模型组小鼠血清中的白蛋白、球蛋白和白球比的值均低于实验组，高剂量NLP调节组的白蛋白含量以及中剂量的NLP预防组的白蛋白和球蛋白的含量均高于空白对照组，说明NLP能够调节小鼠的血清蛋白的水平，从而调节抗生素介导小鼠免疫低下的水平。

3 结 论

本实验使用抗生素建立肠道菌群失调小鼠模型，研究纳豆冻干粉对小鼠免疫调节作用以及对细胞因子分泌水平的影响。实验结果表明：与模型组相比，RN1组能够增加小鼠脾脏指数和胸腺指数，RN1～RN3组能够增加小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量，增强iNOS活力和小鼠血清中的白蛋白、球蛋白含量和白球比，RN1、RN3组能明显增加小鼠血清中NO水平。各组的小鼠血清溶血素水平较对照组明显升高。RN1～RN3组、PN组均能够增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用。与C组相比，调节组小鼠的半数溶血值升高。RN3组和PN组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能增强，巨噬细胞吞噬百分率、鸡红细胞的吞噬数增加。RN3组小鼠血清iNOS活力和白蛋白含量升高，PN组小鼠血清中白蛋白和球蛋白含量升高。与R0组相比，RN3能够增加小鼠脾脏指数和提高IL-20的分泌，RN2、RN3能够增加小鼠IL-2的分泌、巨噬细胞的吞噬功能和血清溶血素水平。与P0组相比，PN组小鼠TNF-α的释放增加、巨噬细胞的吞噬功能增强。综合以上结果，高剂量的NLP（RN3组）对抗生素介导小鼠的免疫调节作用效果最佳。

建立肠道菌群失调模型后，小鼠肠道内益生菌大量死亡，营养物质不能被及时消化，导致小鼠肠道粪便积留，进而影响小鼠肠道上皮细胞的免疫作用。NLP中的胞壁糖、肽聚糖等菌体成分可以作为抗原刺激免疫器官，促进淋巴细胞和巨噬细胞对外来抗原进行抵御和吞噬消化，激活免疫细胞作用病原体。NLP能够恢复小鼠细胞因子的分泌，进而提高免疫功能。本实验结果表明，NLP具有免疫增强作用和增加细胞因子分泌的作用。研究表明，免疫功能与肠道菌群间存在着某种联系［23-25］，而NLP对免疫功能和肠道菌群之间的关系还有待进一步研究。

［1］ BACKX M， FREEDMAN A. Immunization［J］. Medcine， 2009，37（10）： 529-534.

［2］ MABBOTT N A， KOBAYASHI A， SEHGAL A， et al. Aging and the mucosal immune system in the intestine［J］. Biogerontology， 2015，16（2）： 133-145. DOI：10.1007/s10522-014-9498-z.

［3］ UBEDA C， PAMER E G. Antibiotics， microbiota， and immune defense［J］. Trends in Immunology， 2012， 33（9）： 459-466. DOI：10.1016/j.it.2012.05.003.

［4］ CLARKE T B， DAVIS K M， LYSENKO E S， et al. Recognition of peptidoglycan from the microbiota by Nod1 enhances systemic innate immunity［J］. Nature Medicine， 2010， 16（2）： 228-231. DOI：10.1038/ nm.2087.

［5］ HILL D A， HOFFMANN C， ABT M C， et al. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis［J］. Mucosal Immunology， 2010， 3（2）： 148-158. DOI：10.1038/ mi.2009.132.

［6］ MUROOKA Y， YAMSHITA M. Traditional healthful fermented products of Japan［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 2008，35（8）： 791-798. DOI：10.1007/s10295-008-0362-5.

［7］ 张静， 周雯， 李慧， 等. 纳豆片对小鼠免疫功能的影响［J］. 中国卫生检验杂志， 2011， 21（8）： 1939-1941.

［8］ 方少琳， 侯振清. 纳豆冻干粉对小鼠免疫功能作用的研究［J］. 海峡药学， 2009， 21（7）： 51-53.

［9］ 彭亮， 王彦武， 傅伟忠， 等. 纳豆粉对小鼠免疫调节作用的试验研究［J］. 中国食品卫生杂志， 2014， 26（4）： 336-339. DOI：10.13590/ j.cjfh.2014.04.008.

［10］ 沈柱英， 黄占旺， 曹靖文. 纳豆菌糖肽对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用［J］. 营养学报， 2014， 36（4）： 361-365.

［11］ 刘玉军， 张晓峰. 抗生素滥用的危害及防范［J］. 中外医疗， 2012，31（1）： 188-189. DOI：10.3969/j.issn.1674-0742.2012.01.149.

［12］ 李慧， 谢正福. 抗生素对机体免疫功能的影响［J］. 医学综述， 2009，15（14）： 2179-2182. DOI：10.3969/j.issn.1006-2084.2009.14.034.

［13］ SABARIRAJAN J， VIJAYARAJ P， SARKAR M， et al. Effect of lipopolysaccharide on alteration of phospholipids and their fatty acid composition in spleen and thymus by in vitro metabolic labeling［J］. Journal of Applied Toxicology， 2013， 33（6）： 418-425. DOI：10.1002/ jat.1752.

［14］ INOOKA S， UEHARA S， KIMURA M. The Effect of Bacillus natto on the T and B lymphocytes from spleens of feeding chickens［J］. Poultry Science， 1986， 65（6）： 1217-1219.

［15］ 沈柱英.纳豆糖肽的分离纯化、结构表征及其免疫活性研究［D］. 南昌： 江西农业大学， 2014： 14.

［16］ POLA C. Monocytes and macrophages： tissue control of macrophages［J］. Nature Medicine， 2014， 20（6）： 594-595.

［17］ 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范（2003年版）［EB/OL］. （2003-02-14） ［2015-04-20］. http：//www.sdfda.gov.cn/ filedown/admin/12671467264375794242367161.pdf.

［18］ 赖长华. 共轭亚油酸对断奶仔猪免疫应激的调控［D］. 北京： 中国农业大学， 2004： 17.

［19］ FICKENSCHER H， HÖR S， KÜPERS H， et al. The interleukin-10 family of cytokines［J］. Trends in Immunology， 2002， 23（2）： 89-96.

［20］ 孙琳， 毕惠娟， 王健. I型IFN的结构、信号传导和功能［J］. 中国微生态学杂志， 2011， 23（4）： 375-383.

［21］ MAO Kairui， CHEN Shuzhen， CHEN Mingkuan， et al. Nitric oxide suppresses NLRP3 inflammasome activation and protects against LPS-induced septic shock［J］. Cell Research， 2013， 23（2）： 201-212. DOI：10.1038/cr.2013.6.

［22］ KIM D， BECK B R， HEO S B， et al. Lactococcus lactis BFE920 activates the innate immune system of olive flounder （Paralichthys olivaceus）， resulting in protection against Streptococcus iniae infection and enhancing feed efficiency and weight gain in large-scale field studies［J］. Fish and Shellfish Immunology， 2013， 35（5）： 1585-1590. DOI：10.1016/j.fsi.2013.09.008.

［23］ 李雪平， 计成， 刘爱君， 等. 乳酸菌制剂对肉鸡生产性能、免疫功能及肠道菌群的影响［J］. 中国饲料添加剂， 2011（2）： 29-32.

［24］ 黄琴. 芽孢杆菌影响Caco-2、RAW264.7细胞及小鼠免疫功能的研究［D］. 杭州： 浙江大学， 2012： 101-124.

［25］ 周笑犁. 大豆寡糖对肠道微生态与免疫功能的调控作用及机制研究［D］. 南昌： 南昌大学， 2013： 12-15.

Effect of Lyophilized Natto Powder on Antibiotics-Mediated Immunomodulation and Cytokine Secretion in Mice

WU Gaofeng， HUANG Zhanwang*， LIU Wanling， NIU Liya， WANG Suzhen， HUANG Yongping
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food， College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

The effect of natto lyophilized powder （NLP） on antibiotics-mediated immunomodulation and cytokine secretion in SPF mice was explored in the present study. Totally 128 healthy mice were selected and divided randomly into 8 groups：control group （C）， four regulation groups （RN0， 1， 2 and 3）， two prevention groups （P0 and PN）， and model group （M）. The mice in all groups except C were administered with antibiotic solution for 3 days. Thereafter， the mice from group R0 were gavaged with normal saline， while those from group RN1， 2 and 3 were given NLP solution at three different dosages，respectively. The mice from the two prevention groups were continuously daily administered with antibiotic solution； 8 hour later， groups P0 and PN were respectively lavaged with normal saline and NLP solution. The mice in group M were simply given antibiotic solution during the entire administration period of 30 days. Immunomodulatory effects of NLP in mice and its effect on cytokine secretion were determined. Results showed that low-dose NLP resulted in a significant elevation in spleen and thymus indices in mice compared with the model group （P < 0.01）. The production of serum IL-2， IL-10， TNF-alpha，and IFN-gamma extremely significantly increased in groups RN1， RN2 and RN3 compared with the model group（P < 0.01）. In addition， the mice from the three prevention groups showed an extremely significant increase in inducible nitric oxide synthase （iNOS） activity in serum （P < 0.01）， and serum albumin and globulin concentrations and their ratio as well as serum NO level were significantly or extremely significantly higher in the mice from groups RN1 and RN3（P < 0.05 or P < 0.01）. The serum hemolysin levels in mice from the control， regulation and prevention groups were significantly higher than those in the group N （P < 0.01）. The phagocytic capacity of peritoneal macrophages from mice in groups RN1， RN2， RN3 and PN was significantly higher than that of group M. Compared with the control group， the half value of hemolysis （HC50） in groups RN1， RN2 and RN3 was significantly or extremely significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Groups RN3 and PN exhibited an extremely significant increase in the percentage of macrophages engaged in phagocytosis and the percent phagocytosis of chicken red blood cells （P < 0.01）. Therefore， NLP can enhance immune function and increase the secretion of cytokines.

natto lyophilized powder （NLP）； antibiotics； immunomodulatory effect

10.7506/spkx1002-6630-201609036

TS201.3

A

1002-6630（2016）09-0192-06

吴高峰， 黄占旺， 刘宛玲， 等. 纳豆冻干粉对抗生素介导小鼠免疫调节作用及细胞因子分泌的影响［J］. 食品科学， 2016，37（9）： 192-197. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609036. http：//www.spkx.net.cn

WU Gaofeng， HUANG Zhanwang， LIU Wanling， et al. Effect of lyophilized natto powder on antibiotics-mediated immunomodulation and cytokine secretion in mice［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 192-197. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609036. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-09

国家自然科学基金地区科学基金项目（31160337）

吴高峰（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：w1989gf@126.com

*通信作者：黄占旺（1964—），男，教授，学士，研究方向为食品微生物。E-mail：huangzw@163.com