武 娟，刘一鸣，李 夏，王静凤,*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.山东省青岛市第二中学，山东 青岛 266061）

光敏化姜黄素的细胞毒理学检验

武 娟1，刘一鸣2，李 夏2，王静凤1,*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.山东省青岛市第二中学，山东 青岛 266061）

探究基于小鼠成纤维L929细胞的光敏化姜黄素的细胞毒理学。采用倒置显微镜观察细胞形态；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测L929细胞的相对增殖率，按通用标准评价细胞毒性；DNA片段化分析及Hoechst细胞核染色法检测细胞凋亡状况。结果表明：经不同浓度的光敏化姜黄素（5、10、20 μmol/L）处理后，L929细胞生长良好，呈梭形或不规则形状，与对照组相比均无明显差异；毒性级别为“0”或“1”，即无细胞毒性；在琼脂糖凝胶电泳图上未见“阶梯状”的条带出现，细胞核染色后也呈现正常的蓝色，即光敏化姜黄素不会引起L929细胞凋亡，对L929细胞没有毒性。

光敏化姜黄素；细胞毒性；四甲基偶氮唑蓝实验；细胞凋亡

姜黄素是从姜科姜黄属（Curcuma longa）植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然黄色酸性酚类物质，是姜黄发挥药理作用的最主要的活性成分[1-3]。根据GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》的规定，姜黄素是允许在食品中使用的9 种天然色素之一。近年来的研究发现，姜黄素是一种新型光敏剂[4-5]，其成本低、无污染、具有光活性，能够起到杀菌和治疗肿瘤的功效[6-7]。相关文献报道发光二极管（light-emitting diode，LED）蓝色光源波长为470 nm，可以激活姜黄素而发挥其光敏活性[8-9]。为了将该技术在日常生活中推广应用，需要对光敏化姜黄素进行毒理学研究。

已有研究报道单纯的姜黄素经大鼠和小鼠急性毒性实验确认属于实际无毒物质，未见潜在的致突变、致微核及致畸作用，无明显亚慢性毒性损害作用[10-11]。但是光敏化姜黄素是否无毒需要进一步验证。近年来，细胞培养技术被广泛应用于毒理学研究，而整体动物的中毒表现都继发于机体细胞中出现的改变，所以直接观察受试物对细胞的作用应看作是对其毒理学本质的研究[12]。虽然离体培养细胞没有完整机体所存在的神经-体液调节作用的影响，但却有利于准确控制其外环境的理化因素，能够在稳定的条件下观察离体培养细胞对化学物质毒性作用的反应，可以在其他体外毒性评价实验系统和整体动物系统之间起到填补差距的桥梁作用[12]。小鼠成纤维细胞L929细胞系是研究细胞毒理学的常用细胞系[13-17]。在此基础上，本实验将光敏化姜黄素作用于L929细胞系，初步评价其细胞毒理学，为探究光敏化姜黄素的食用安全性以及姜黄素介导的光动力非热力杀菌技术在日常生活中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜黄素（食品级添加剂） 陕西慈缘生物技术有限公司；小鼠成纤维细胞L929细胞系由中国海洋大学海洋生命学院赠予。

DMEM高糖培养基、新生牛血清 美国HyClone公司；青霉素-硫酸链霉素双抗混合液（100×） 江苏恩莫阿赛生物技术有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine]ethanesulfonic acid，HEPES）缓冲液 德国Sigma公司；DNA Marker DL2000 日本TaKaRa生物工程有限公司；组织/细胞基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒 碧云天生物技术研究所；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）袋装预混试剂 北京康为世纪生物科技有限公司；二甲基亚砜 上海伟进生物科技有限公司；琼脂糖 美国Lonza Rockland公司；6 孔细胞培养板、96 孔细胞培养板 美国Corning公司；细胞培养基除菌过滤器 美国Millipore公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

超净工作台 苏净集团安泰公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；Fluo ViewTM FV1000显微镜日本Olympus公司；细胞培养箱 美国NuAire公司；Tanon凝胶成像系统 上海天能科技有限公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂；激光共聚焦显微镜 中国科学院青岛生物能源与过程研究所；LED新型光源系统（470 nm的蓝色光源，光功率密度60 mW/cm2）香港中文大学中医学院。

1.3 方法

1.3.1 L929细胞培养

本实验选用细胞为小鼠成纤维细胞L929细胞系，用含10%新生牛血清的DMEM细胞培养基在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养并消化传代。

1.3.2 光敏化姜黄素的样品制备

将姜黄素样品分成实验组和对照组，实验组为光敏化姜黄素实验组（添加LED光照的姜黄素，L＋S＋组），对照组包括单纯LED光照组（添加LED光照的溶剂，L＋S－组）、单纯姜黄素处理组（添加不光照的姜黄素，L－S＋组）和空白对照组（不加姜黄素，不光照，L－S－组）。其中L＋S＋组的光敏化姜黄素设置为5、10、20 μmol/L 3 个浓度组[18]。姜黄素由食品级乙醇溶解，储备液浓度为20 mmol/L。用基础培养基稀释后，于波长为470 nm的LED蓝色光源下（光功率密度60 mW/cm2）光照1 min，即光能量密度为3.6 J/cm2。光动力处理之后，0.22 μm无菌滤膜过滤，待用。

1.3.3 样品与细胞共培养

L929细胞复苏传代后，于对数生长期用0.25%胰酶消化后吹散，作细胞计数，用含10%新生牛血清的DMEM高糖培养基调整细胞浓度至0.2×105个/mL[19]。用微量移液器以100 μL/孔置于96 孔板中复种6 孔，L－S－组只加含10%新生牛血清的DMEM培养基，在5% CO2、37 ℃标准环境下贴壁生长24 h。添加光敏化姜黄素继续培养细胞24、48、72、96 h，于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.4 四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）实验及毒性评分

分别于24、48、72、96 h后各取出一块培养板，吸弃细胞上清液，每孔加200 μL MTT溶液（MTT溶于DMEM（1∶8，m/V）），继续培养4 h。弃上清液，每孔加入150 μL酸化异丙醇溶液，充分溶解细胞沉淀，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。按照公式（1）计算L929细胞的相对增殖率（relative growth rate，RGR）[19]。

根据计算所得RGR值按表1所示的评分标准定出光敏化姜黄素的毒性级别。0 级和1 级被认为没有细胞毒性，2 级为具有轻度细胞毒性或结合细胞形态综合评价，3 级和4 级为具有中度细胞毒性，5 级为具有明显的细胞毒性，3～5 级为不合格材料。

表1 细胞毒性评分标准Table1 Cytotoxicity grades and corresponding relative growth rates

1.3.5 细胞DNA的提取及片段化分析[20]

以光敏化姜黄素处理L929细胞，培养96 h后收集细胞，按照组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取DNA。提取出的DNA用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在100 V电泳1 h，紫外灯下拍照。

1.3.6 Hoechst细胞核染色

取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5 min，用无菌的PBS洗涤3 遍，再用细胞培养液洗涤1 遍。将盖玻片置于6 孔板内，L929细胞复苏传代后，于对数生长期用0.25%胰酶消化后吹散，作细胞计数，用含10%新生牛血清的DMEM高塘培养基调整细胞浓度至0.2×105个/mL[19]。以2 mL/孔置于6 孔板中复种6 孔，在5% CO2、37 ℃标准环境下贴壁生长24 h。以光敏化姜黄素处理L929细胞，培养96 h后吸尽培养液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS于摇床上洗两遍，每次3 min。吸尽液体，加入0.5 mL Hoechst染色液，于摇床上染色5 min。去染色液，用PBS于摇床上洗两遍，每次3 min。吸尽液体，将贴有细胞的盖玻片用镊子夹出，于荧光显微镜下观察拍照，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。凋亡的细胞经染色后，在荧光显微镜下观察，细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染，颜色有些发白，而正常细胞的细胞核呈正常的蓝色。每个样品随机计数4 个视野，按照公式（2）计算细胞凋亡率。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 光敏化姜黄素对L929细胞形态的影响

以不同浓度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黄素处理L929细胞，经过24、48、72、96 h孵育之后，于倒置显微镜下观察细胞的形态变化。由图1可知，在不同浓度的光敏化姜黄素处理下，L929细胞生长良好，呈梭形或不规则形状，与3 个对照组相比均无明显差异。参照形态分析标准，初步证实浓度低于20 μmol/L的光敏化姜黄素是没有细胞毒性的。

图1 倒置显微镜下L929细胞的形态观察（×1100）Fig.1 Morphology of L929 cells under inverted microscope (× 10)

2.2 光敏化姜黄素对L929细胞增殖的影响及毒性评分

20 μmol/L以下的光敏化姜黄素对L929细胞形态没有显著影响，进而以5、10、20 μmol/L光敏化姜黄素处理L929细胞一段时间（24、48、72、96 h）之后，评价其对L929细胞相对增殖率的影响及毒性评分。

图2 MTT检测光敏化姜黄素对L929细胞增殖率的影响Fig.2 Effect of photoactivated curcumin on L929 cell proliferation rate by MTT detection

由图2可知，经MTT实验检测发现，L＋S＋组的A570nm与3 个对照组相比均没有显著差异（孵育相同时间组内相比）；由表2可知，L929细胞的相对增殖率虽有所降低，但与3 个对照组相比均无显著差异，均属RGR分级标准的“0”级或“1”级，再次证实了低于20 μmol/L的光敏化姜黄素无细胞毒性。

表2 L929细胞的相对增殖率及姜黄素毒性评分Table2 Relative growth rates of L929 cells and corresponding toxicity scoorreess

2.3 光敏化姜黄素对L929细胞凋亡的影响

细胞凋亡时，细胞核内的内切核酸酶被活化，将DNA链在核小体连接区域切断，形成若干（180～200 bp）n寡聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状图谱，这被作为判断细胞凋亡是否发生的客观依据之一[20]。如图3所示，以不同浓度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黄素处理L929细胞96 h之后，没有发现DNA的典型梯状条带出现，以上结果提示浓度低于20 μmol/L的光敏化姜黄素不会引起L929细胞凋亡。

图3 琼脂糖凝胶电泳分析L929细胞DNA片段化Fig.3 DNA fragmentation analysis of L929 cells by agarose gel electrophoresis

Hoechst细胞核染料是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。它是一种特异性DNA染料，在活细胞中DNA聚A-T序列富集区域的小沟处与DNA结合。当细胞发生凋亡时，染色质会固缩。细胞经染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒块状荧光[21-22]。如图4所示，以不同浓度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黄素作用L929细胞96 h之后，经细胞核染色发现光敏化姜黄素实验组的细胞核染色状况与3 个对照组相比没有明显的变化。每个样品随机计数4 个视野的细胞凋亡率，统计结果如图5所示，空白对照组的细胞在培养96 h后存在一定凋亡，不同浓度的光敏化姜黄素实验组的细胞凋亡率与空白对照组相比没有显著差异，再次验证了浓度低于20 μmol/L的光敏化姜黄素不会引起L929细胞凋亡。

图4 激光共聚焦显微镜观察L929细胞核染色Fig.4 L929 nuclear staining observed under CLSM

图5 L929细胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rate of L929 cells

3 讨 论

大量研究表明，姜黄素具有广谱的生理以及药理作用，具有较强的抗炎、抗氧化和抗癌效应，而且对正常细胞的杀伤作用不敏感。由于姜黄素具有抗癌谱广、毒副作用小的优点，已成为目前抗癌药物的研究热点。

近年来，人们发现光敏化姜黄素能更加有效地杀灭恶性肿瘤细胞。例如，曾霞波等[8]研究证实，光敏化姜黄素能有效杀伤和抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长。王杜娟等[23]证实光敏化姜黄素可显著诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。田斌强等[24]研究表明，姜黄素能明显抑制膀胱癌细胞系UMUC2的生长并诱导其凋亡。近些年，研究者们又逐渐将光敏化姜黄素应用于杀灭致病性微生物[25-27]。本课题组前期的研究证实，浓度为5、10、20 μmol/L的光敏化姜黄素对食品中的微生物有较好的灭活效果[28]。为了将光敏化姜黄素在日常生活中推广应用，需验证其具有食用安全性。然而，迄今为止，光敏化姜黄素的毒理学评价尚未见报道。

细胞毒理学是研究外源性物质对细胞损伤作用规律及其机制的毒理学分支学科，它可以用于食品安全毒理学的评价、食品中有害物质的毒作用机理研究、食品加工生产中有毒有害物质的检测、功能性食品中功效成分的活性研究等[29-30]。细胞毒理学的研究方法有多种，包括对细胞的活 性影响和遗传学影响、造成细胞形态学变化以及细胞凋亡检测。目前在食品领域应用较广泛的细胞毒理学方法有MTT比色实验、细胞DNA合成测定法、Western blotting法、流式细胞术测定法等[29]。Pi oletti等[31]认为，当受试物与细胞共培养时，一旦受试物有毒，细胞的增殖情况和形态就 会发生改变。本研究结果表明，以浓度为5、10、20 μmol/L的光敏化姜黄素孵育L92 9细胞一段时间后，细胞生长状态良好，与对照组相比无明显差异，即光敏化姜黄素无细胞毒性。上述结果将为开展光敏化姜黄素在食品、餐具和桌面等消毒中的应用提供了依据。但本研究只是对光敏化姜黄素的细胞毒性进行了初探，其食用安全性尚有待于通过开展动物及人体毒理学实验进一步验证。

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Cytotoxicological Test of Photoactivated Curcumin

WU Juan1, LIU Yiming2, LI Xia2, WANG Jingfeng1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Qingdao No.2 Middle School of Shandong Province, Qingdao 266061, China)

The main purpose of this research was to explore the cytotoxicity of photoactivated curcumin based on fibroblast cell line L929. The cell morphology was examined by an inverted microscope, relative growth rate (RGR, %) was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method, cytotoxicity was evaluated according to the general standard, and cell apoptosis was detected by DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining, respectively. Results showed that photoactivated curcumin did not affect cell morphology, which was fusiform or irregular in shape and had no significant difference when compared with the control group. It had no cytotoxicity with the toxicity grade “0” or “1”, and did not cause apoptosis according to DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining. This study confirmed that photoactivated curcumin had no toxicity to L929 cells at the concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L. These results will lay a foundation for exploring the safety of consumption of photoactivated curcumin and provide the theory basis for the popularization and application of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization technology in daily life.

photoactivated curcumin; cytotoxicity; methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201603037

TS201.6

A

1002-6630（2016）03-0205-06

武娟, 刘一鸣, 李夏, 等. 光敏化姜黄素的细胞毒理学检验[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 205-210. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

WU Juan, LIU Yiming, LI Xia, et al. Cytotoxicological test of photoactivated curcumin[J]. Food Science, 2016, 37(3): 205-210. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

海洋公益性行业科研专项（201105029）

武娟（1988—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与营养。E-mail：932837429@qq.com

*通信作者：王静凤（1964—），女，教授，博士，研究方向为海洋食品功效成分的分子营养学。E-mail：jfwang@ouc.edu.cn