崔 凯，耿慧武，姬 强，朱克超，卢 晨，夏 杰，刘晓颖，于在诚

受体相互作用蛋白激酶1在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

崔 凯1，耿慧武2，姬 强2，朱克超1，卢 晨1，夏 杰3，刘晓颖2，于在诚1

目的 探讨受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）蛋白在食管鳞癌中的表达情况及临床意义。方法 应用Western blot法和免疫组织化学法检测并且分析100例食管鳞癌患者的癌组织、相应癌旁组织和对应正常黏膜组织中RIP1的表达情况。结果 71%食管鳞癌组织中RIP1蛋白的表达水平高于对应癌旁组织和正常黏膜组织，20%食管鳞癌癌旁组织RIP1蛋白的表达水平高于对应癌组织和正常食管黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。食管鳞癌组织中高表达的RIP1蛋白水平与其TNM分期、病理分级、有无淋巴结转移有关（P＜0.05），与性别、年龄无关。癌旁组织中高表达的RIP1蛋白水平与肿瘤浸润深度、TNM分期有关（P＜0.05），与性别、年龄、有无淋巴结转移及病理分级无关。结论 RIP1蛋白在食管鳞癌中的高表达可能与肿瘤的病理分级、TNM分期及预后有关，对于食管鳞癌的发生发展有一定的预测作用。

食管肿瘤；鳞状细胞；免疫组织化学；受体相互作用蛋白激酶1

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率居我国恶性肿瘤的第四位，食管癌绝大部分是鳞状细胞癌，原发腺癌较少见。其早期无明显典型症状，偶有下咽异物感、胸骨后疼痛等。手术是治疗食管癌的首选方法，但手术切除率仅为58%～92%，且术后5年生存率仍不到40%［1］，食管恶性肿瘤的早期发现与治疗能够大大提高患者的手术切除率和5年生存率。受体相互作用蛋白1（receptor interacting protein kinase 1）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可以通过激活NF-κB、活化Caspase-8、参与活性氧的产生等方式，在细胞凋亡、细胞存活及细胞程序性坏死等信号传导中起关键作用［2］。另外其功能受泛素化、锌指蛋白等的调节［3］。目前关于RIP1在食管癌发生发展中的作用研究较少。该研究旨在通过检测100例食管鳞癌患者的癌组织、相应癌旁及正常食管黏膜组织中RIP1的表达情况，分析RIP1在食管鳞癌的早期诊断、分化程度及预后中的相关意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集安徽医科大学第一附属医院胸外科2014年10月～2015年7月手术切除的食管鳞癌标本100例，术前均经胃镜活检病理诊断明确，术前均未经放疗、化疗。男73例，女27例；年龄36～84（60.34±10.42）岁。手术切除标本后分别于病灶中心、癌旁（距病灶2 cm以内）及距病灶5 cm外正常食管黏膜切取少许组织两份，一份立即放入-80℃保存，用Western blot法检测RIP1的表达；另一份立即用4%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋备用，其余大体标本立即置10%福尔马林固定送入病理科，常规石蜡包埋、切片、HE染色，行病理学诊断。所有病例按《食管癌的国际TNM分期标准（2009年第7版）》进行分期。

1.2 主要试剂与仪器 Western IP细胞裂解液、BCA定量试剂盒和一抗、二抗稀释液均购自上海碧云天公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、SP 9000通用型免疫组化试剂盒、DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司；兔抗人RIP1单克隆抗体购自美国Sigma公司；Tissue lyser组织破碎仪购自德国QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法检测RIP1的表达 每个病例的食管癌组织、癌旁组织及相应癌旁正常食管黏膜组织作为自身对照。尽量剪碎组织，加入细胞裂解液，于Tissue lyser组织破碎仪上破碎，4℃、14 000 r/min离心10 min，收集上清液，蛋白定量30 μg，取出相应上清液与等量2×SDS上样缓冲液混合，沸水浴5 min、冰浴2 min后进行SDS-PAGE电泳2 h，转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），100 V恒压电转1 h，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h，用含0.05%Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，RIP1抗体（1∶500，用一抗稀释液稀释）4℃过夜孵育，用TBST洗膜后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释）室温作用2 h，TBST洗膜后用ECL试剂盒显色，在暗室中用X线片曝光并显影和定影，X线片晾干后扫描（以GAPDH作为上样内参照），运用Image J和Graphpad Prism 5.0软件进行蛋白显影后图像分析，运用t检验进行数据处理。

1.3.2 免疫组化法检测RIP1的表达 采用免疫组化SP法，严格按照说明书进行操作：每步用PBS工作液洗3次，每次3 min，3%过氧化氢20 min阻断内源性过氧化物酶，非免疫血清作用20 min，RIP1一抗1∶200稀释，4℃孵育过夜；生物素标记的二抗（1∶500稀释）孵育30 min，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育30 min，DAB显色，然后常规HE复染、脱水、封片在显微镜下观察。

1.3.3 免疫组化结果判定 采用光学显微镜观察RIP1的表达情况，取高倍视野（×400）进行观察，细胞膜及细胞质呈棕色、棕褐色为阳性表达细胞。取3个不同的视野进行观察，计数每个视野下100个细胞的染色情况，取平均值。按阳性表达细胞数及染色强度进行评分：阳性表达细胞数（0：阳性细胞数0～10%，1：阳性细胞数11%～25%，2：阳性细胞数26%～50%，3：阳性细胞数51%～75%，4：阳性细胞数76%～100%）；染色强度（0：无黄染，1：浅黄色，2：深黄色，3：棕褐色）。总分=阳性细胞表达数+染色强度，＞4分者为阳性（+），≤4分者为阴性（-）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析。运用t检验进行数据处理。组间差异比较采用χ2检验及Fisher's确切概率法。

2 结果

2.1 Western blot法检测RIP1蛋白的表达情况

应用Western blot法检测部分病例食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织及正常黏膜组织中RIP1的表达情况，结果显示71%样本中RIP1在食管鳞癌组织中的表达高于癌旁组织和正常黏膜组织（P＜0.05），见图1。20%样本中RIP1在食管鳞癌患者癌旁组织中的表达高于鳞癌组织和正常黏膜组织（P＜0.05），见图2。

2.2 免疫组化法检测RIP1蛋白的表达情况

RIP1阳性染色主要定位于细胞膜和细胞质中，为不均匀的棕黄色颗粒，无规律地散在分布于癌组织中。71%样本中RIP1在食管鳞癌组织中的表达高于癌旁组织和正常黏膜组织，见图3。20%样本中RIP1在食管鳞癌患者癌旁组织中的表达高于鳞癌组织和正常黏膜组织，见图4。

图1 Western blot法检测RIP1蛋白的表达情况

2.3 RIP1在食管鳞癌中的表达与临床病理指标的关系 100例食管鳞癌组织中RIP1阳性表达且高于癌旁组织及相应正常食管黏膜组织71例，占71%，癌旁组织阳性表达且高于癌组织20例，占20%；癌组织中高表达的RIP1蛋白的表达水平与其TNM分期、病理分级、有无淋巴结转移有关（P＜0.05），与患者的性别、年龄无关，见表1。癌旁组织中高表达的RIP1蛋白的表达水平与肿瘤浸润深度、TNM分期有关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、有无淋巴结转移及病理分级无关，见表2。

图2 Western blot法检测RIP1蛋白的表达情况

3 讨论

图3 免疫组化法检测RIP1蛋白的表达情况 SP×400

图4 免疫组化法检测RIP1蛋白的表达情况 SP×400

表1 癌组织中高表达的RIP1与临床病理指标的关系

表2 癌旁组织中高表达的RIP1与临床病理指标的关系

恶性肿瘤的发生发展与癌细胞的存活增殖密切相关，RIP1的泛素链的锚定位置决定了其作为一个存活的基础架构或是细胞凋亡信号的功能。赖氨酸63连接泛素链的RIP1参与调控NF-κB通路［4］以此促细胞增殖，RIP1转变泛素链锚定位置［5］后可与FADD和Caspase-8结合形成复合体Ⅱa［6］，执行细胞凋亡。另外RIP1与RIP3通过RHIM结构域相互作用形成的淀粉样沉积物在执行细胞程序性坏死过程中必不可少［7］。说明RIP1在肿瘤细胞的存活增殖、凋亡及程序性坏死等信号传导中起着中枢调控的作用。

对人类黑色素瘤中RIP1的研究［8］表明沉默RIP1可以一定程度抑制黑色素瘤细胞的增殖，小鼠动物实验也证实RIP1的沉默可以一定程度上延缓肿瘤细胞的生长。另外，乳腺癌、神经胶质瘤的发生发展与过表达的RIP1相关［9］。刘复兴等［10］在评估RIP1在食管鳞癌的表达状况中，发现RIP1在癌组织的表达显著高于对应正常食管组织，且其表达水平与肿瘤的分期、分级、有无淋巴结转移、浸润深度呈正相关性。本研究中，食管癌组织RIP1的阳性表达率为71%，主要定位于肿瘤细胞的细胞质。中晚期患者癌组织中的表达情况明显高于对应癌旁及正常食管黏膜组织，提示RIP1可能与食管鳞癌TNM分期及食管鳞癌细胞增殖有关。这与以往研究结果一致，提示在食管鳞癌中RIP1促进癌细胞增殖。章余妹等［11］发现在顺氯氨铂（cisplatin）诱导食管癌细胞凋亡过程中，DDP处理后的食管癌细胞株RIP1表达水平增高，联合RIP1特异性抑制剂后，较敏感的KYSE510细胞株凋亡率明显减少，推测DDP可能通过转变RIP1上泛素化链锚定位置［12］进而导致肿瘤细胞程序性凋亡。关于RIP1泛素化链锚定位置对食管鳞状癌细胞生存、增殖的影响需进一步研究来证实。

本研究还表明部分病例癌旁组织中RIP1的表达水平高于相应癌组织及正常食管黏膜组织，占早中期病例的31%。此种情况下，食管鳞癌癌旁组织中RIP1表达水平高于癌组织且与肿瘤TNM分期呈负相关性，推测部分早中期食管鳞癌组织中RIP1可以通过形成复合体Ⅱ执行细胞凋亡的方式抑制早期恶性肿瘤细胞的存活增殖。食管鳞癌患者癌旁RIP1的表达水平对诊断肿瘤的TNM分期有一定参考意义。

另外，癌旁组织中该蛋白的表达水平与肿瘤病理分级无关，结合癌组织中该蛋白表达与肿瘤病理分级的关系，考虑RIP1表达水平可能与肿瘤组织的恶性程度相关，从而能够作为食管鳞癌患者判断预后的一个参考指标。由于RIP1具备多个结构域，在细胞信号转导中的作用更为复杂，其泛素化、磷酸化等修饰作用异常所导致的结果与食管鳞癌的关系等仍需要进一步的研究。

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Receptor interacting protein kinase 1 expression in esophageal squamous carcinoma and clinical significance

Cui Kai1，Geng Huiwu2，Ji Qiang2，et al
（1Dept of Thoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；

2Faculty of Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective The investigation of the expression and clinical significance of receptor interacting protein kinase 1（RIP1）in esophageal squamous cell carcinoma.Methods Immunohistochemistry and Western blot analysis were applied to detect and analyze the expression of RIP1 in cancer tissue and the relevant pericarcinomatous tissue，as well as in the corresponding normal esophageal mucosa in 100 cases of ESCC patients.Results RIP1 expression levels in 71%of cases were demonstrated to be the highest in cancer tissue，then in pericarcinomatous tissue and normal esophageal mucosa in sequence，with statistical significance（P＜0.05）.20%of cases indicated that expression of RIP1 in pericarcinomatous tissue relating to esophageal squamous carcinoma was higher than that in cancer tissue and normal esophageal mucosa orderly（P＜0.05）.The investigated up-regulated expression of RIP1 in cancer tissue was proved to be relevant with TNM stage，pathologic grade and lymph node metastasis（P＜0.05），while it was not associated with sex and age.The up-regulated expression of RIP1 in pericarcinomatous tissue was suggested to be corresponding to invasion depth and TNM stage（P＜0.05），but not to sex，age lymph node metastasis or pathological grading.Conclusion The up-regulated expression of RIP1 in esophageal squamous carcinoma is supposed to be relevant to pathological grading，TNM stage and prognosis，which also is effective in the genesis and development of esophageal squamous carcinoma.

esophageal neoplasms；squamous cell；immunohistochemistry；receptor interacting protein kinase 1

R 735.1；R 341

A

1000-1492（2016）08-1175-05

时间：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.046.html

2016-04-19 接收

国家自然科学基金青年基金（编号：81201368）

1安徽医科大学第一附属医院胸外科，合肥 230022

2安徽医科大学生命科学学院生物学系，合肥 230032

3安徽医科大学第四附属医院急诊外科，合肥 230011作者简介：崔 凯，男，硕士研究生；

于在诚，男，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：yuzaicheng@vip.sina.com