邓立方，朱友明，王银龙

HIF-1α基因介导的牙髓干细胞在体外的成血管作用

邓立方，朱友明，王银龙

目的 探索低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因诱导牙髓干细胞（DPSCs）在体外的成血管作用。方法 对HIF-1α进行基因突变，构建突变型、野生型以及对照组的慢病毒载体；体外培养DPSCs；分别用3种慢病毒转染DPSCs后，检测细胞转染效率、目的基因HIF-1α在mRNA及蛋白水平的表达，MTT法检测慢病毒载体对细胞增殖的影响；目的基因转染成功后，qPCR、Western blot法检测HIF-1α调控DPSCs成血管因子的表达。结果 MTT结果表明慢病毒载体对DPSCs的增殖几乎无影响。qPCR和Western blot法检测目的基因HIF-1α成功表达，HIF-1α能够显著上调DPSCs的成血管因子的表达（P＜0.05）。突变组和野生组的成血管作用明显强于对照组（P＜0.05），而突变组又优于野生组（P＜0.05）。结论 HIF-1α基因可以促进DPSCs血管向分化作用。

HIF-1α；DPSCs；慢病毒转染；成血管

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）有很强的增殖能力和多向分化的潜能，随着基因工程和组织工程技术的发展，DPSCs越来越多地被用作修复受损组织或器官的转基因靶细胞［1］。低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是HIF-1的活性单位，调控数百种基因的转录活性，涉及骨髓源性血管细胞生成、血管反应、动脉血管形成等［2］。HIF-1α蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节［3］，为了使其在常氧状态下实现稳定表达并且能够保持高度活性，对HIF-1α基因进行抗降解突变和保持活性突变［4］。研究［5］表明血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以显著增强DPSCs成血管的活性，而HIF-1α作为VEGF的上游靶基因，其在诱导DPSCs成血管作用方面具有更大的优势。骨修复和再生

中，血管与骨形成是相辅相成不可分开的，HIF-1α是此生物学过程中必需的关键性因子［6］。该研究拟运用基因增强组织工程技术，将HIF-1α基因稳定转染至DPSCs中，探索HIF-1α在体外的成血管作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司）；HIF-1α、成血管抗体（英国Abcam公司）；qPCR试剂盒（日本TaKa-Ra公司）；PVDF膜（美国Invitrogen公司）；细胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒载体Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ的构建 首先将野生型的HIF-1α基因（wild type HIF-1α，WT）进行基因突变为突变型HIF-1α（mutant type HIF-1α，MT）：402位脯氨酸（Pro 402）突变成丙氨酸（Ala 402），803位天冬酰胺（Asn 803）突变成丙氨酸（Ala 803），564位脯氨酸（Pro 564）突变成丙氨酸（Ala 564）。然后分别合成过表达载体pcDNA6.2-WT及pcDNA6.2-MT，通过BP/ LR重组后，构建慢病毒载体Lenti-WT、Lenti-MT和Lenti-LacZ。最后病毒包装后进行滴度测定。

1.2.2 DPSCs的培养和分离 临床收集年轻因正畸需要拔除的健康前磨牙或阻生齿，无菌条件下劈开牙齿取出牙髓，剪碎。先在培养皿中滴入1滴培养液，用消毒过的镊子将剪碎的组织放入培养液中，铺平勿重叠。用无菌凡士林涂于盖玻片四角，将盖玻片轻轻盖在组织上，使其贴壁生长，切勿产生气泡。最后加入适量培养液于恒温培养箱中培养，1周后有细胞爬出，待细胞长满状态良好进行传代。

1.2.3 HIF-1α基因转染DPSCs最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）值的测定 DPSCs培养至第3代，按2×105/孔将细胞接种于6孔板中，设定MOI值分别为2、4、6、8、10，将病毒转入细胞中。转病毒后每天观察各孔中的荧光表达情况，选择荧光细胞达到一定比例的最低MOI值作为最佳的MOI值。

1.2.4 MTT比色分析慢病毒对DPSCs细胞增殖水平的影响 将DPSCs铺入96孔板中，第2天弃去培养液和未贴壁的细胞，每个基因分5组，每组设6孔，转病毒Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT，常规培养。连续7 d每天先向各孔中加入5 mg/ml的MTT各20 L，培养箱培养4 h后，再分别每孔加入150 μl的DMSO并置于摇床上缓慢震荡30 min使结晶物充分溶解。最后用酶标仪测定各孔490 nm处的吸光度值。实验重复3次，取均值。

1.2.5 qPCR法测定目的基因HIF-1α以及成血管相关因子（VEGF、SDF-1、Ang-2）的mRNA的表达

选择状态良好、处于对数生长期的DPSCs细胞进行铺板。首先用0.25%胰酶消化后1 000 r/min离心5 min，用完全培养基将细胞沉淀重悬获得单细胞悬液，细胞计数，按照每孔2×105个细胞传于6孔板中。待细胞生长至60%～70%融合度时，按照之前测定的最佳MOI值加入相应体积的慢病毒转染DPSCs细胞，实验分组为Lenti-LacZ/DPSCs、Lenti-WT/DPSCs、Lenti-MT/DPSCs。分别于转染后0、1、4、7、14及21 d收集细胞。TRIzol法提取细胞总RNA，核酸蛋白测定仪测定DNA浓度及纯度，RNA纯度为260/280 1.7～1.9，按照Invitrogen试剂说明书反转录cDNA置-20℃保存备用。最后按qPCR仪设定的PCR扩增体系进行PCR扩增，系统自带软件显示各样本Ct值，将标本检测所得的Ct值与相应的β-actin基因Ct值相减，进行标准化，校正标本RNA质量和反转录效率的差别，实验重复进行3次。ΔCt=CtHIF-1α-Ctβ-actin。ΔΔCt定义为ΔCt不同处理组-ΔCt未转染组，计算2-ΔΔCt进行相对定量。

1.2.6 Western blot法检测HIF-1α蛋白以及成血管相关蛋白（VEGF、SDF-1、Ang-2）的表达 实验分组同qPCR，分别于病毒转染后0、1、4、7、14及21 d收集细胞。加入2 μl蛋白酶抑制剂及200 μl细胞裂解液，置于冰袋上，摇床缓慢震荡15 min，吹打收集细胞中的蛋白。最后于4℃、12 000 r/min离心10 min。BCA法测定蛋白质浓度，确定电泳每孔上样量为30 μl。用10%的SDS-聚丙稀酰胺凝胶分离胶，湿式电转移法将蛋白转移至PVDF膜。TBST冲洗3次，每次10 min，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液附一抗，4℃过夜。第2天在室温下附二抗2 h后TBST洗涤3次。DAB显色，暗室曝光、显影。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 细胞转染效率检测 DPSCs转染病毒7 d后，病毒转染效果最好。倒置荧光显微镜观察MOI=10 pfu/cell时，转染效率最高，达90%以上，DPSCs保持增殖状态。见图1。

图1 细胞转染结果 ×500

2.2 慢病毒转染对DPSCs增殖的影响 在目的基因转染DPSCs后1～7 d进行MTT检测，结果显示，转基因组吸光度值高于LacZ组，MT组大于WT组（图2）。这些结果也说明构建的突变型HIF-1α基因在体外常氧条件下可以稳定过表达并保持高度活性。另外，MTT结果表明慢病毒载体对DPSCs的增殖几乎没有什么影响，而且HIF-1α基因还有促进DPSCs增殖的作用。

图2 慢病毒转染对DPSCs增殖的影响

2.3 目的基因检测 实时定量PCR结果显示，Lenti-MT组目的基因转染DPSCs后，第1天HIF-1αmRNA的表达开始增高，7 d后达到高峰，14、21 d虽有降低但仍维持在很高水平。Lenti-MT组的HIF-1α表达与Lenti-WT组转染1 d后就出现差异，7 d及21 d mRNA的表达量，Lenti-MT组几乎比Lenti-WT组高出1倍（P＜0.05），Lenti-WT组HIF-1a mRNA的表达缓慢增长后逐渐降低。Lenti-LacZ组虽然也有少量HIF-1α的表达，但其与目的基因组相比，4、7、14、21 d差异均有统计学意义（F=6.167，P＜0.05）。蛋白水平的表达趋势与mRNA相符，LacZ组几乎看不到HIF-1α蛋白的表达，而Lenti-MT组蛋白表达水平不断升高，Lenti-WT组则相对稳定。见图3。

图3 目的基因检测

2.4 HIF-1α促进DPSCs成血管因子mRNA表达的检测 检测3个（VEGF、SDF-1、Ang-2）与成血管作用密切相关的基因。其中，VEGF基因在第4天Lenti-MT组的表达量为Lenti-LacZ组的2～3倍（F =3.329，P＜0.05）（图4 A）。SDF-1基因第4天时Lenti-MT组为Lenti-LacZ组的4～5倍，第7天为10～15倍（F=6.231，P＜0.05）（图4 B）。Ang-2基因第7天、第14天Lenti-MT组为Lenti-LacZ组的20～30倍（F=2.457，P＜0.05）（图4 C）。此外，成血管基因在Lenti-MT组的表达水平与Lenti-WT组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 HIF-1α促进DPSCs成血管因子蛋白表达的检测 基因转染后0、1、4、7、14、21 d，收集细胞，Western blot法检测成血管相关蛋白的表达。在目的基因转染后第1天，VEGF和SDF-1蛋白表达增高，其过表达持续到第21天。Lenti-WT组和Lenti-MT组的VEGF蛋白表达水平与Lenti-LacZ组比较差异有统计学意义（P＜0.01），VEGF蛋白Lenti-MT组高于Lenti-WT组（P＜0.05），SDF-1蛋白Lenti-MT组与Lenti-WT组之间无显著差异。Ang-2蛋白在目的基因转染后第4天出现过表达，第7～14天表达水平持续增高，与基因表达趋势几乎一致，Lenti-WT组和Lenti-MT组显著高于Lenti-LacZ组（P＜0.05），同时，Lenti-MT组明显高于Lenti-WT组（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

近年来有关骨组织工程的研究越来越多，其与同种异体骨和自体骨相比有很多的优点。当人体硬组织由于外伤或肿瘤等原因缺损时，可选择组织工程骨加以修复。但当组织工程骨的厚度超过100～200 μm，必须在骨中形成血管才能为细胞提供氧及各种营养物质并且运输出代谢废物［7］。因此，骨组织工程中种子细胞复合支架材料后，除了要有细胞因子的诱导，还需要成功建立血运循环。

图4 qPCR分析目的基因转染DPSCs后在成血管相关基因的表达

图5 Western blot法检测成血管相关蛋白的表达

VEGF是重要的促进血管生成因子，其被低氧激活后，对诱导血管的发生起关键作用。但是仅凭VEGF调控不能获得稳定且成熟的血管网［8］。HIF-1α是VEGF、SDF-1和Ang-2等成血管因子的上游调控基因，其具有更好的促血管生成作用［9］。低氧状态下HIF-1α是血管发生的中心调控因子，调控其他生长因子的表达，直接参与血管发生的整个生物学过程［10］。

DPSCs作为种子细胞有4个优点：①获取方便：可从脱落的乳牙或者拔除的正畸牙、智齿的牙髓中分离得到；②细胞扩增后可再植于自体需要修复的组织中，从而避免了免疫抑制剂的使用［11］；③多向分化：DPSCs来源于间叶组织能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元等［12］；④高度增殖：DPSCs的体外培养增殖速度是骨髓间充质干细胞的30～50倍，比骨髓间充质干细胞具有更高的克隆形成能力［13］；目前DPSCs的研究是口腔医学领域中的一个热点。

综上所述，本实验采用基因突变技术对HIF-1α基因进行区域突变，实现体外常氧条件下HIF-1α的稳定表达并保持其高度活性。然后构建Lenti-WT、Lenti-MT及Lenti-LacZ慢病毒载体，将上述载体成功转染DPSCs后，体外检测HIF-1α诱导DPSCs成血管因子（VEGF、SDF-1及Ang-2）的表达情况。初步证实了体外HIF-1α基因促进DPSCs成血管的作用，体外实验结果为体内动物实验研究奠定了基础。但是HIF-1α体外诱导DPSCs成血管分化的作用机制以及如何在体内促进血管重建，还需要进一步的探索。

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On HIF-1α gene in promoting the formation of blood vessel by DPSCs in vitro

Deng Lifang，Zhu Youming，Wang Yinlong
（Stomatologic Hospital&College，Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the function of HIF-1α gene in promoting the differentiation of dental pulp stemcells（DPSCs）into blood vessels in vitro.Methods HIF-1α gene was mutated.The lentiviral vectors of Lenti-WT，Lenti-MT and Lenti-LacZ were constructed.The DPSCs were cultured and treated with three lentiviral vectors.Then the cells transduction efficiency and the expression of target gene at the level of mRNA and protein were detected.The influence on cell proliferation from lentiviral vectors was detected by MTT.After transduction，RNA and protein were extracted，the expression of angiogenic factor was detected by qPCR and Western blot.Results

HIF-1α；DPSCs；lentivirus transfection；angiogenesis

R 782

A

1000-1492（2016）08-1120-05

时间：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.020.html

2016-05-04 接收

国家自然科学基金（编号：31501103）

安徽医科大学口腔医学院，安徽医科大学附属口腔医院，

安徽省口腔疾病研究中心实验室，合肥 230032

邓立方，女，硕士研究生；

王银龙，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangylah@sina.com

MTT showed that there was no effect on DPSCs proliferation from lentiviral vectors.The results of qPCR and Western blot showed that HIF-1α gene was located in cell nucleus，expression of target gene was detected at both mRNA and protein level.After gene transduction，expression of angiogenic factor at the mRNA and protein levels was significantly increased（P＜0.05）.The formation of blood vessel in Lenti-MT and Lenti-WT groups was better than that in Lenti-LacZ group（P＜0.05），and the best result was found in Lenti-MT group（P＜0.05）.Conclusion

HIF-1α could promote DPSCs to form blood vessels.