蔡婷，　徐顾榕，　林 凯，　宋菲菲，　张其圣，陈　功，　蔡义民，　张　庆，　向文良*

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都610039；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都 611130；3.日本国际农业科学研究中心，日本 筑波30528686）

发酵用鲜辣椒中乳酸菌抗生素耐药性与耐药基因

蔡婷1，徐顾榕1，林 凯1，宋菲菲1，张其圣2，陈功2，蔡义民3，张庆1，向文良*1

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都610039；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都 611130；3.日本国际农业科学研究中心，日本 筑波30528686）

以四川泡菜发酵用的新鲜二荆条辣椒表面上附着的乳酸菌为研究对象，分析其对四环素（TET）、链霉素（STR）和红霉素（ERY）的耐药性与耐药基因。研究表明：用于发酵的鲜辣椒中，乳酸菌的含量约为2.18×104CFU/g，属于Weissella cibaria（61.93%）、Lactococcus lactis（16.06%）、Enterococcus mundtii（5.50%）、Enterococcus faecalis（3.67%）、Enterococcus hirae（3.67%）、Leuconostoc mesenteroides（6.88%）和Leuconostoc holzapfelii（2.29%）。所有218株分离株均无ERY耐药，但其中30株（13.76%）表现出TET和STR耐药，包括10株W.cibaria（4.59%）、2株Lac.lactis（0.92%）、1株 E.mundtii（0.46%）、2株 Leu.mesenteroide（0.92%）和 1株Leu.holzapfelii（0.46%）STR耐药菌株，9株W.cibaria（4.12%）、2株Lac.lactis（0.92%）、1株E.faecalis（0.46%）和2株E.hirae（0.92%）TET和STR二重耐药菌株；除TET和STR二重耐药菌株W.cibaria CT024中未检出任何TET被检基因外，其它耐药株都有相应1个或多个被检基因被检出。其中，在5种STR被检耐药基因中，strB的检出率最高，达60.00%；aad6的检出率最低，为16.67%。11种TET被检耐药基因中，tetB和tetC的检出率最高，达到85.71%；tetZ的检出率最低，为7.14%。同时，同种内的不同菌株对STR或TET的耐药性高低与耐药基因的种类和数量多少无相关性。

鲜辣椒；乳酸菌；抗生素耐药性；抗生素耐药基因

抗生素耐药性作为一种新型污染物于2006年由美国学者Pruden首先提出［1］，由于在环境介质中的持久残留以及在不同宿主间的传播往往比抗生素本身危害更大，因此其对公共健康和食品安全构成的威胁目前已成为植物学、土壤学、环境科学和食品科学等领域的研究热点［2-4］。发酵蔬菜是一类以新鲜蔬菜为原料，在盐存在条件下，经乳酸菌等有益微生物发酵而成的一种食品。长期以来，发酵食品中的乳酸菌被认为是安全的。但是近年来，随着发酵食品中乳酸菌的抗生素耐药性被大量发现，曾经认为是安全的发酵食品也出现了可转移的抗生素耐药性，为发酵食品的安全带来了新的挑战［5］。

蔬菜发酵技术是世界上最为古老的一种生物储藏技术，是我国先民在生物技术领域对世界的一大贡献。辣椒发酵是辣椒加工的一种重要方式，在中国民间历史悠久，发酵方式多样［6］。鲜辣椒经乳酸菌发酵后的辣椒制品，不仅具有脆嫩芳香、解腻开胃、酸辣鲜纯正等独特的风味，而且其中富含的乳酸菌具有防便秘、降胆固醇、抗肿瘤以及调节人体各种生理机能等保健功效，因此深受消费者喜爱［7］。然而，近年来随着抗生素耐药性污染的加剧，中国常见的传统发酵蔬菜产品中也发现了较高比例的抗生素耐药菌株，为中国传统发酵蔬菜的食品安全埋下了安全隐患［8-10］。过去人们通常认为：发酵食品原料中抗生素的残留是导致生产过程中耐药菌产生的主要原因。然而，新的研究结果表明：环境介质中的抗生素残留水平除了对耐药细菌的选择以外，几乎没有环境毒性风险［11］。因此，食品原料和加工环境中被污染的耐药菌在食品生产过程中的增殖或耐药性的水平传播是食品生产过程中产生的新的耐药菌的主要原因。

辣椒表面的乳酸菌是辣椒自然发酵微生物的主要来源。尽管大多数与食物相关的乳酸菌“一般被认为是安全的”［12］，但是近年来乳酸菌可转移耐药性的发现为乳酸菌的安全性敲响了警钟。辣椒在种植过程中，环境中的耐药菌不可避免会附着在辣椒表面，尽管浓度低，但是一旦它们进入发酵系统，就可能向其它微生物传播抗生素耐药性，造成耐药菌群的扩大。基于此，作者以四川某泡菜企业用于发酵的新鲜二荆条辣椒表面附着的乳酸菌为研究对象，以辣椒种植过程中常用的农用抗生素链霉素、四环素和红霉素为选择因子，分析其抗生素耐药性，并检测耐药基因，以期为发酵辣椒选用安全的辣椒原料提供参考，确保发酵辣椒的食品安全。

1　材料与方法

1.1材料

辣椒：四川某泡菜企业用于发酵的新鲜二荆条辣椒，产地分布在西南、西北和东南省份；培养基：MRS与及改良的MRS琼脂培养基 （含0.75%的CaCO3）［13］；链霉素（STR）、四环素（TET）和红霉素（ERY）标准品：北京标准品中心。

1.2方法

1.2.1菌株分离与生化特征分析随机选取上述产地新鲜辣椒各1 kg，混匀后装入盛有3 000 mL无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器Bagmixer均质5min。取适量均质液，10倍梯度稀释后涂布于改良MRS琼脂培养基上，37℃培养48 h。选取菌落适宜的平板统计菌落数，并挑取有明显溶钙圈的菌落于MRS平板上划线纯化。纯化菌株接种到MRS液体培养基中富集培养后，转移至30%的无菌甘油冻藏管中，-20℃保藏备用。菌株的生理生化特征按《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》进行［13］。

1.2.2RAPD聚类分析菌株基因组DNA的提取和RAPD聚类分析参见Xiang［14］等的方法。PCR扩增引物为G1：5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’和L1：5’-CAAGGCATCCACCGT-3’。PCR扩增条件：94℃变性1 min，55℃退火2 min，72℃ 延伸3 min，25个循环。扩增产物经PAGE电泳后，条带用LabImage 2.7.1识别并转化成0/1矩阵，NTSYS PC 2.11做非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmeticmean，UPGMA）聚类分析［15-16］。

1.2.316S rRNA序列分析16S rRNA扩增与序列分析见Xiang［17］等的方法。PCR扩增引物为Eu27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1490R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR条件：95℃预变性5 min，然后95℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃保持10 min。PCR产物连接到pGEM-T载体后克隆入感受态E.coli DH5α中，提取重组质粒，测定16S rRNA序列。通过CLASSIFIER（RDPII，http：//rdp.cme.msu. edu./classifier/classifier.jsp）软件，无嵌合体的16S rRNA序列与RDP数据库中的模式菌株的进行相似性比较，确定菌株的分类学地位。

1.2.4抗生素耐药性分析依据欧洲微生物药物敏感委员会（http：//www.eucast.org）关于微生物对抗生 素 的 敏 感 阈 值X（http：//www.eucast.org/ mic_distributions/），分析菌株的抗生素耐药性。当分离菌株的最小抑菌质量浓度 （Minimal Inhibitory Concentration，MIC）≤Xμg/mL时，为敏感菌株；反之，则为耐药菌株。

MIC测定采用微量肉汤稀释法［18］。分别将链霉素（STR）、四环素（TET）和红霉素（ERY）配制成2 048μg/mL的贮存液，MRS液体培养基2倍梯度稀释成使用液。STR质量浓度为2～1 024μg/mL，TET和ERY质量浓度为1～512μg/mL。向无菌的96孔板中加入198μL含不同质量浓度抗生素的MRS液体培养基后，接种2μL菌株的培养液 （约1.0×107CFU/mL），37℃静止培养24 h后，统计不同菌株的MIC。每组重复3次，并设置对照组。

1.2.5抗生素耐药基因分析PCR检测菌株的STR耐药报告基因aph（3'）-IIIa、strA、strB、aadA和aad6［19-20］；TET耐药报告基因 tetB、tetC、tetD、tetG、tetH、tetK、tetM、tetS、tetT、tetX和tetZ［21-23］；ERY耐药报告基因ermA、ermB和mphA［22，24］。PCR程序：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，待检基因引物的退火温度见表1。退火30 s，72℃延伸1min，30次循环后72℃延伸5 min。1.0 g/dL的琼脂糖电泳检测扩增产物，胶回收与上述报告基因的大小相同的片段。回收片段连接到pGEM-T载体后，克隆入感受态E.coli DH5α中，测定扩增片段序列，NCBI中利用BlastX程序比对扩增序列，进一步判断分离株是否含有上述被检耐药基因。

2　结果与分析

2.1RAPD聚类与生化特征分析

乳酸菌是指发酵时能够产生乳酸的一大类细菌，包括40个属，近300个种。MRS平板分离乳酸菌时，利用其产生的乳酸溶解CaCO3形成溶钙圈的特性，即可实现乳酸菌的初步分离。在当前研究中，10 g鲜辣椒均质液在稀释度为10-1、接种200μL时，平板上有溶钙圈的菌落共计218个，表明用于发酵的鲜辣椒原料中，附生乳酸菌的含量约为2.18×104CFU/g。基于RAPD的UPGMA聚类分析发现：218株乳酸菌共分为7个群，见图1。其中，菌株CT002代表的群最大（135株），约占61.93%；菌株CT081、CT110、CT142、CT147、CT217和CT218代表的群中，分别有12（5.50%）、8（3.67%）、8（3.67%）、15（6.88%）、5（2.29%）和35（16.06%）株乳酸菌。218株乳酸菌对糖和醇的利用特征进一步证实了RAPD分类的正确性，见表2。

表1　被检抗生素耐药基因的PCR引物序列、退火温度和扩增片段大小Table 1　PCR primer，anneal tem perature and am plified fragment length of antibiotic resistance genes

图1　发酵用的鲜辣椒中乳酸菌的RAPD聚类分析Fig.1　RAPD cluster analysis of LABs on the fresh hot pepper used to fermentation

2.216S rRNA序列分析

为进一步确定分离株的分类学地位，在上述7个乳酸菌群中，小于10株的群随机选取5株、10～ 30株的群随机选取10株、大于30株的群随机选取15株，大于50株的群随机选取25株，大于100株选取30株进行16S rRNA序列分析。结果表明：用于发酵的新鲜辣椒原料中，附生乳酸菌分为Weissella、Enterococcus、Leuconostoc和 Lactococcus属，见表3。

CT002群属于Weissella属，抽检菌株的16S rRNA序列与W.cibaria LMG 17699T的16S rRNA皆表现出100%相似性。同时，CT002群中的菌株对糖或醇的利用也与LMG 17699T表现一致，因此，CT002群中的乳酸菌被鉴定为W.cibaria。

CT081、CT110和CT142群皆属于Enterococcus属。3个群中，抽检菌株的16S rRNA序列分别与E.mundtii ATCC 43186T、E.faecalis JCM 5803T和E.hirae DSM 20160T的16S rRNA相似99%。三个群中的菌株对糖和醇的利用也分别与各自群的相似菌株表现相同。因此，CT081、CT110和CT142群中的乳酸菌分别被鉴定为E.mundtii、E.faecalis和E.hirae。

CT147和CT217群中的菌株均属于Leuconostoc属。两个群中，抽检菌株的16S rRNA序列皆以100%相似性分别与Leu.mesenteroide ATCC 8293T和Leu.holzapfelii LMG 23990T的16S rRNA相似。两群中的菌株对糖和醇的利用也分别与ATCC 8293T和LMG 23990T表现相同。因此，CT147和 CT217群中的乳酸菌分别被鉴定为 Leu. mesenteroide和Leu.holzapfelii。

表2　发酵用的鲜辣椒中乳酸菌的生理生化特征Table 2　Physiological and biochem ical characteristics of LABs on the fresh hot pepper used to fermentation

表3　发酵用的鲜辣椒中乳酸菌基于16S rRNA的分类学地位Table 3　M icrobial classification of LABs on the fresh hot pepper used to fermentation by 16S rRNA

CT218群属于Lactococcus属，抽检菌株的16S rRNA序列与Lac.lactis NCDO 604T的16S rRNA序列相似性为99%。对糖和醇的利用，CT218群中的菌株与NCDO 604T表现一致。因此，CT218群中的的乳酸菌被鉴定为Lac.lactis。

2.3抗生素耐药分析

依据欧洲微生物药物敏感委员会关于上述乳酸菌对STR、TET和ERY的阈值X，比较分离株相应的MIC，见表4。发现218株乳酸菌中有30株具有被检抗生素的耐药性，耐药菌株比例为13.76%。其中，STR单一耐药菌株16株 （7.34%），TET和 STR二重耐药菌株14株（6.42%），无菌株表现ERY耐药性。在30株STR和TET的单一或二重耐药菌株中，同种的不同乳酸菌株对TET或STR的MIC值不同，表现出了耐药性差异。W.cibaria CT032、CT065对STR的耐药性最强，二者的MIC值是相应的敏感阈值（64μg/mL）的16倍，达1 024μg/mL。

在135株W.cibaria中，有19株（8.70%）表现出了被检抗生素的耐药性。其中，有10株（4.59%）STR单一耐药，9株 （4.13%）TET和STR的二重耐药；在35株Lac.lactis中，有4株（1.83%）表现出了被检抗生素的耐药性。其中，2株 （0.92%）TET和STR二重耐药，2株（0.92%）STR耐药；在 12株E.mundtii、8株E.faecalis和8株E.hirae中，分别有1株（0.46%）STR耐药、1株（0.46%）TET和STR二重耐药和2株 （0.92%）TET和STR二重耐药；在15株Leu.mesenteroide和5株Leu.holzapfelii中，分别有2株（0.92%）和1株（0.46%）STR单一耐药。

表4　发酵用的鲜辣椒中STR、TET和ERY耐药乳酸菌的M IC和抗生素耐药性Table 4　M ICs and antibiotic resistance of the STR，TET and ERY resistant LABs on the fresh hot pepper used to fermentation　μg/mL

2.4抗生素耐药基因分析

在30株STR和TET单一或二重耐药菌株中，除STR和TET二重耐药菌株W.cibaria CT024中未检出TET被检耐药基因外，其它耐药菌株都有相应一个或多个被检基因被检出。W.cibaria CT024未检出当前的TET被检耐药基因，表明CT024中有其它TET耐药基因存在。在STR耐药菌株，strB的检出率最高，达60.00%，其次是aph（3'）-IIIa，检出率为53.30%。其它STR耐药基因strA、aadA和aad6的检出率分别为36.67%、20.00%和16.67%。TET耐药菌株中，tetB和tetC检出率最高，达到85.71%；tetS、tetX、tetK、tetT、tetH、tetM、tetD和tetZ的检出率分别为62.29%、57.14%、50.00%、21.43%、21.43%、21.43%、14.29%和7.14%。W.cibaria CT003是当前耐药基因检测种类出最多的菌株，包括5种STR基因，4种TET耐药基因；W.cibaria CT024、W.cibaria CT030、W.cibaria CT032、W.cibaria CT096、W.cibaria CT203、Leu.holzapfelii CT217、E.hirae CT142、E.mundtii CT081、E.faecalis CT110和Lac.lactis CT218分别仅有一种STR耐药基因。

在TET耐药W.cibaria菌株中，11种TET被检基因皆被部分检出，但不同株的被检基因种类不尽相同。在具有同样MIC的STR耐药W.cibaria菌株中，除CT03中5种被检基因全部检出外，其它菌株中皆被部分检出，检出基因的类型也不尽相同。Lac.lactis、E.hirae和Leu.mesenteroide中的不同耐药菌株对STR和TET的耐药基因分布也表现出了与W.cibaria类似的情况。上述结果表明：当前被检菌株中，同种内的不同菌株对STR或TET的耐药性的高低与相应耐药基因的种类和数量多少无相关性，见图2。

图2　发酵用的鲜辣椒中STR和TET耐药乳酸菌的STR和TET耐药基因分布Fig.2　STR and TET resistance gene distribution of STR and TET resistant LABs on the fresh hot pepper used to fermentation

3　结语

长期以来，人们对蔬菜安全性的关注多集中在蔬菜农残和重金属等一些理化指标上，很少注重其中的微生物指标，特别是微生物抗生素耐药性指标［2］。蔬菜在其种植过程中接触的水体、土壤、空气及肥料中不可避免存在耐药性菌株，因此，当传统意义上合格的蔬菜作为发酵蔬菜原料时，其安全性是值得讨论的。当前的研究表明：用于发酵的鲜辣椒原料中，乳酸菌的含量约为2.18×104CFU/g，主要属于 W.cibaria（61.93%）、Lac.lactis（16.06%）、E.mundtii（5.50%）、E.faecalis（3.67%）、E.hirae（3.67% ）、Leu.mesenteroide（6.88% ） 和Leu. holzapfelii（2.29%）。所有218株乳酸菌分离株均无ERY耐药性，但有30株表现出了TET和STR耐药，约占分离株的13.76%。其中，STR单一耐药菌株16株 （7.34%），STR和TET二重耐药菌株14株（6.42%），在这些耐药菌株中，同种内的不同菌株对STR或TET的MIC值不同，表现出了耐药性差异。同时，同种内的不同菌株对STR或TET的耐药性高低与耐药基因的种类和数量多少无相关性。

Leu.mesenteroide、Lac.lactis和W.cibaria是发酵蔬菜中常见的乳酸菌。在用于发酵的辣椒原料中，这些菌中STR和TET单一或二重耐药的发现为发酵辣椒的原料安全敲响了警钟。因此，需建立抗生素耐药性乳酸菌的检测与防控体系，确保未经二次灭菌即可直接食用的发酵辣椒的食品安全，维护广大消费者的健康权益。

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会议信息

会议名称（中文）：第十三届国际工业微生物遗传学大会

会议名称（英文）：13th International Symposium on the Genetics of IndustrialMicroorganisms（GIM2016）

所属学科：动植物微生物学，生物物理学、生物化学及分子生物学，遗传与发育生物学

开始日期：2016-10-16

结束日期：2016-10-20

所在城市：湖北省武汉市

具体地点：武汉东湖国际会议中心

主办单位：武汉大学、中国科学院上海生物工程研究中心

会议主席：邓子新 武汉大学、武汉生物技术研究院

E-MAIL：GIM2016@163.com

会议网站：http://gim2016.cn

会议背景介绍：第十三届国际工业微生物遗传学大会（GIM2016）将于2016年10月16-20日在武汉东湖国际会议中心举行。本届大会将为全世界微生物遗传学领域的科研工作者们提供一个促进交流、加强合作的高端平台，会议为所有与会者精心安排了涵盖微生物遗传基础研究与应用研究前沿的主题分会以及墙报展示。会议真诚地邀请相关领域的国内外专家学者在此汇聚一堂，展示最新科研成果。

Investigation of Antibiotic Resistance and Resistant Genes of Lactic Acid Bacteria on the Fresh Hot Pepper Used to Fermentation

CAITing1， XU Gurong1，LIN Kai1，SONG Feifei1，ZHANGQisheng2，CHEN Gong2，CAIYimin3， ZHANG Qing1，XIANGWenliang1*
（1.College of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries，Chengdu 611130，China；3.Japan International Research Center for Agricultural Sciences，Tsukuba 30528686，Japan）

The antibiotic resistance and resistant genes of lactic acid bacteria（LABs）were investigated on the fresh hotpepperused to fermentation.In currentstudy，218 isolates suggested that about2.18×104CFU/g LABswere on the fresh hot pepper used to fermentation.These isolateswere assigned to Weissella cibaria（61.93%），Lactococcus lactis（16.06%），Leuconostoc mesenteroides（6.88%），Enterococcusmundtii（5.5%），Enterococcus faecalis（3.67%），Enterococcus hirae（3.67%）and Leuconostoc holzapfelii（2.29%）.Of the 218 isolates，no one displayed the resistance of erythromycin（ERY），but 30 isolates（13.76%）were found to be against streptomycin（STR）and tetracycline（TET）w ith one or two resistance，including 10 W.cibaria（4.59%），2 Lac.lactis（0.92%），1 E.mundtii（0.46%），2 Leu.mesenteroides（0.92%）and 1 Leu.holzapfelii（0.46%）w ith resistance to STR，And 9W.cibaria（4.12%），2 Lac.lactis（0.92%），1 E.faecalis（0.46%）and 2 E.hirae（0.92%）w ith resistance of TET and STR.In the TET and STR resistant strain W.cibaria CT024，none of TET resistantgeneswas found.While，the other TET and STR resistant strains had harbored one or more corresponding resistant genes.In 5 STR resistant genes had the highest detection rate w ith 60.00%，but aad6 w ith only 16.67%.Among 11 TET resistant genes，tetB and tetC had the highestdetection rate，85.71%，and tetZwas foundw ith 7.14%lowestdetection rate.For the currentantibiotic resistant strains，the STR or TET resistantphenotype of differentstrains in the same species was not directly related to the types or quantities of the corresponding antibiotic resistantgenes.

fresh pepper，lactic acid bacteria，antibiotic resistance，antibiotic resistantgenes

TS 201.3

A

1673—1689（2016）09—0941—09

2015-01-21

国家自然科学基金项目（31571935）；教育部春晖计划项目（Z2014061）；四川省应用基础项目（2014JY0045）；四川省教育厅重点项目（14ZA0110）；四川省食品生物技术重点实验室项目（SZJJ2014-007）。

向文良（1973—），男，四川仁寿人，理学博士，教授，硕士研究生导师，主要从事中国西南地区特色发酵食品微生物分子生态与生物过程学方面的研究。E-mail：xwllm7687@sina.com