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CotA漆酶催化靛蓝胭脂红脱色条件优化1)

2016-11-07范丽莉王炎赵敏王珏玉赵美邢丹

东北林业大学学报 2016年9期
关键词:胭脂红脱色染料

范丽莉 王炎 赵敏 王珏玉 赵美 邢丹

(哈尔滨工业大学,哈尔滨,150001) (东北林业大学)



CotA漆酶催化靛蓝胭脂红脱色条件优化1)

范丽莉 王炎 赵敏 王珏玉 赵美 邢丹

(哈尔滨工业大学,哈尔滨,150001) (东北林业大学)

采用Plackett-Burman试验设计法及响应面分析优化了重组细菌漆酶CotA催化靛蓝胭脂红脱色的条件。经过Plackett-Burman试验筛选出影响脱色条件的主要因素为pH、温度和染料质量浓度。利用Box-Behnken中心组合试验设计及响应面分析,通过三元二次数学模型进行回归拟合,预测了靛蓝胭脂红染料最佳脱色条件为:pH=8.6,温度60 ℃,染料质量浓度41.5 mg·L-1,染料在最优方案条件下45 min内的脱色率实际检测值为91.40%,与预测值的误差仅为0.86%。以上结果显示,CotA漆酶在靛蓝胭脂红脱色领域具有较好的应用前景。对脱色产物进行液相质谱分析,检测到m/z=216.07 [M-Na]-的脱色产物,推测该降解产物为4-氨基-3-羧基苯磺酸钠,证明CotA漆酶催化靛蓝胭脂红降解。

CotA;靛蓝胭脂红;染料脱色;响应面优化

The decolorization of Indigo carmine by the CotA laccase was detected. The decolorization conditions were optimized by the Plackett-Burman test design method and response surface method. The Plackett Burman experiment design was conducted to select the relatively important factors in indigo carmine decolorization. The temperature, pH and concentration of dye were the three significant factors influencing the dye decolorization. Using Box-Behnken center combination experiment design and response surface analysis, the optimal operating condition was with pH of 8.6, 60 ℃ and 41.5 mg·L-1indigo carmine, and the dye decolorization rate was 91.40% within 45 min which was only with 0.86% difference from the forecast value. The results indicated that the promising prospects of the recombinant CotA laccase in indigo carmine decolorization. The molecular ions (m/z=216.07[M-Na]-) were obtained and identified by LC/MS. Therefore, the indigo carmine was degraded to 4-Amino-3-carboxybenzenesulfonic acid sodium salt and the indigo carmine could be degraded by the CotA laccase.

靛蓝胭脂红(IC)是一种应用非常广泛的靛蓝类染料,可用于牛仔裤和其他蓝色织物的染色,靛蓝胭脂红还可以作为分析化学中指示剂以及用于显微镜观察的染色剂[1]。此外,靛蓝胭脂红在食品、药品和化妆品工业中都有所应用[2]。然而这类靛蓝染料可以引发肿瘤致癌,并可导致生殖、发育和神经性疾病,威胁人体健康[3],因此脱色降解水体中的靛蓝胭脂红对于减小该染料造成的污染至关重要。目前已有一些利用物理吸附的方法去除废水中靛蓝胭脂红的报道,使用的吸附材料包括壳聚糖[4]和活性炭[5]等。然而这些物理方法只能从液体中吸附分离染料,还需要继续处理才能将染料脱色降解。化学处理需要向染料溶液中加入新的化学成分,这往往会对环境造成二次污染。酶催化的方法可以加速染料的脱色和分解,效率高且污染小,是一种更加环保的染料处理方法。利用高效的酶催化靛蓝胭脂红脱色降解将成为减小靛蓝胭脂红污染的重要途径。

CotA蛋白是一种来源于芽孢杆菌的细菌漆酶,属于多铜氧化酶家族[6]。水是CotA漆酶催化底物反应的唯一的副产物,因而CotA漆酶是一种典型的“绿色催化剂”。CotA漆酶与其他漆酶相比具有热稳定性高和更加耐碱的特点,更适合处理高温碱性染料废水[7]。CotA漆酶催化染料脱色反应受多种因素相互影响,寻找最佳的染料脱色条件对于促进染料脱色降解具有重要意义。本研究探索了CotA漆酶对靛蓝胭脂红染料的脱色能力,并以靛蓝胭脂红的脱色率为响应值,在Plackett-Burman[8-9]试验和Box-Behnken[10-11]中心组合试验的基础上用响应面法对CotA催化靛蓝胭脂红的脱色条件进行优化,探究了CotA蛋白催化染料靛蓝胭脂红脱色的最佳条件及各影响因素间的交互作用,为含靛蓝胭脂红废水的治理提供参考和依据。利用液相质谱对脱色产物分析,证明了CotA对靛蓝胭脂红的降解能力。

1 材料与方法

1.1 CotA漆酶活性的检测

CotA漆酶的制备方法参见文献[12]。漆酶单位U定义为在30 ℃、pH=4.6条件下,1 min内催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。反应体系为:200 μL酶液、1 mL 3 mmol·L-1的ABTS和1.8 mL pH=4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。以1 mL 3 mmol·L-1的ABTS、2 mL pH=4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为空白对照。在30 ℃水浴锅中反应3 min后,测定反应体系420 nm处的吸光度值。酶活力计算公式为:

U=((AV/εDt)/V0)×103。

式中:A为测得的420 nm处吸光度值;V为酶催化反应体系的总体积;ε为ABTS氧化产物在420 nm处的消光系数(36 000 L·mol-1·cm-1);D为比色皿的宽度;t为反应时间;V0为加入酶的体积。所有测量均重复3次取平均值。

1.2 CotA漆酶催化靛蓝胭脂红脱色

为证实CotA漆酶催化靛蓝胭脂红脱色的能力,利用光谱仪对含酶和不含酶的靛蓝胭脂红溶液经紫外可见光谱扫描。脱色反应体系为20 mL,其中靛蓝胭脂红20 mg·L-1,脱色缓冲液为pH=8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,酶浓度为0.1 U·mL-1。对照溶液不含酶,染料和缓冲液相同。2组溶液在37 ℃条件下振荡反应,每10 min进行一次光谱扫描。

靛蓝胭脂红的脱色率计算公式为:D=((Ai-At)/Ai)×100%。式中:Ai是脱色前染料溶液610 nm处的吸光度值,At是脱色一定时间后染料溶液610 nm处吸光度值。

1.3 靛蓝胭脂红脱色条件优化

1.3.1 Plackett-Burman试验

通过单因素试验对pH、温度、反应时间、酶浓度、染料质量浓度5个因子进行筛选,得出参试因素优化范围。每个因素分别取低(-1)和高(+1)2个水平,如表1所示。利用Design-Expert软件中的Plackett-Burman设计进行12组试验,每组试验3次重复取平均值。

表1 Plackett-Burman中各水平因素变量取值

1.3.2 响应面试验

根据Plackett-Burman试验结果,选取3个主要因素(pH、温度、染料质量浓度)进行响应面试验。根据Box-Benheken中心组合试验设计原理,以pH、温度、染料质量浓度作为优化因子,每个因子设置3个水平,以(-1、0、1)进行编码,其中0为中心点,-1和1分别代表相应的低值和高值,如表2所示。以染料脱色率为响应值。中心点试验重复5次,以估计试验误差。通过软件Design-Expert对响应面试验结果进行分析,绘制响应面曲线图和等高线图,其中响应面曲线图是在3个试验因素中固定一个变量(取0水平,即pH=8.5、温度55 ℃或染料质量浓度45 mg·L-1)进行降维分析,得到相应的三维曲面图。

按照响应面试验得到的优化条件组合进行3次靛蓝胭脂红脱色重复试验,结果取平均值。将实际的脱色率试验结果与响应面优化的脱色率理论预测值比较,验证响应面优化结果是否与实际相符。

表2 Box-Benheken中各水平变量取值

1.4 染料脱色产物液相色谱质谱鉴定

用截留相对分子质量为10 000的超滤管将染料降解产物与CotA酶等大分子物质分离,收集小分子脱色产物。液相色谱条件为:Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇和水(50∶50),柱温为25 ℃,流速为0.5 mL·min-1。质谱检测为电喷雾离子化方式,选择负离子模式检测。

2 结果与分析

2.1 CotA催化靛蓝胭脂红脱色

为验证CotA漆酶对靛蓝胭脂红溶液的脱色能力,对含CotA和不含CotA的靛蓝胭脂红溶液进行紫外可见光谱扫描,结果如图1所示。靛蓝胭脂红在可见区608 nm处有特征吸收峰。不含CotA漆酶的靛蓝胭脂红溶液在pH=8.0的缓冲溶液中稳定,震荡80 min后608 nm处吸光光度值几乎没有变化。加入CotA漆酶的染料溶液608 nm处的吸光度值逐渐降低,脱色80 min后几乎无色,靛蓝胭脂红脱色率达80%。以上结果表明,在CotA漆酶的催化作用下靛蓝胭脂红溶液由蓝色逐渐脱色变成无色,靛蓝胭脂红中2个羰基和碳碳双键形成的共轭结构被破坏,CotA漆酶能够催化靛蓝胭脂红脱色。

图1 靛蓝胭脂红溶液的紫外可见光谱(间隔10 min)

2.2 影响靛蓝胭脂红脱色的因素

Plackett-Burman试验设计用于筛选影响靛蓝胭脂红脱色率的主要因素。按表1设计的因素水平,设计了12个试验点进行靛蓝胭脂红脱色试验,结果见表3。对表3的数据进行方差分析,结果如表4所示。以p<0.01为选择标准,筛选出3个影响脱色率的显著因素,分别为pH、温度和染料质量浓度,而反应时间和酶浓度p>0.01,影响不显著。因此,选择pH、温度和染料质量浓度3个因素进行后续染料脱色条件优化。

表3 变量的Plackett-Burman试验编码值和染料脱色检测结果

试验序号pH温度/℃反应时间/min酶浓度/U·L-1染料质量浓度/mg·L-1降解率/%1-1-11-112.612-111-1111.8431-111-138.894-1-1-11-17.20511-1-1-142.016111-1-168.4571-111124.268-1-1-1-1-13.299-11-1118.88101-1-1-114.031111-11140.9212-1111-132.35

表4 Plackett-Burman试验方差分析结果

2.3 响应面法优化靛蓝胭脂红降解条件

利用Expert-desigen软件用-1、0、1对pH、温度和染料质量浓度这3个显著影响脱色率的因素进行编码。靛蓝胭脂红脱色率为响应值。通过Box-Behnken设计对三因素进行优化,共17次试验,其中中心点试验5次。Box-Behnken试验设计和相应染料脱色试验结果如表5所示。

表5 Box-Behnken试验设计及结果

脱色率=84.590 0+6.360 0X1+6.110 0X2-4.830 0X3-

0.002 5X1X2+0.530 0X1X3-1.300 0X2X3-

该模型的p<0.000 1,差异极显著,并且失拟项p=0.124>0.050,表明失拟不显著,说明该方程拟合度很好,方程能很好地描述各因素与脱色率之间的关系。该模型变异系数为1.81%,低于10%,表明试验操作可信。信噪比的值通常大于4,说明模型有足够分辨力。本试验测得的信噪比为42.631,说明该模型分辨力较好;预测相关系数0.947 2与校正相关系数0.99相近,试验误差小。该三元二次回归方程的决定系数R2=0.995 6,接近1,表明该模型可以解释99.56%的试验所得的染料脱色率变化,用该方程预测CotA漆酶对靛蓝胭脂红的脱色是合适的。

表6 Box-Behnken试验方差分析结果

根据以上拟合的三元二次回归方程,利用Design-Expert软件绘制响应曲面图及其等高线图。每个响应面代表了当一个变量处于最佳水平时,另外2个独立变量之间的相互作用。等高线图中同一椭圆型的曲线上染料的脱色率是相同的,染料脱色率在椭圆形区域中心值最高,由中心向边缘逐渐降低(图2—图4)。各图中反应时间和酶质量浓度是固定的,分别为45 min和120 mg·L-1。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱大小,椭圆形表示两因素有交互作用显著,圆形表示不显著[13-14]。从等高线可以看出,pH、温度和染料质量浓度对靛蓝胭脂红的降解率存在交互作用。综合方差分析的结果可知,在所选取的因素水平范围内,各因素对降解率的影响由大到小依次为:pH、温度、染料质量浓度。

图2 温度和pH对靛蓝胭脂红脱色率影响的3D响应面(a)和等高线图(b)

图3 染料质量浓度和pH对脱色率影响的3D响应面(a)和等高线图(b)

通过拟合方程求出靛蓝胭脂红的脱色最佳条件:pH=8.58,温度59.97 ℃,染料质量浓度为41.4 mg·L-1。该条件下CotA漆酶对靛蓝胭脂红的脱色率理论值为92.2%,考虑到实际操作和试验仪器的局限性,修正后的最佳工艺条件为:pH=8.6,温度60 ℃,染料质量浓度为41.5 mg·L-1,在此条件下进行了3次重复染料脱色验证试验,脱色45 min染料脱色率的平均值为91.4%,与理论值相差较小,说明试验设计和响应面法优化得到的降解脱色工艺参数准确可靠,与未优化之前45 min脱色率61.2%有大幅度提高。

2.4 靛蓝胭脂红脱色产物鉴定

为证明CotA能够催化染料靛蓝胭脂红降解并鉴定降解产物,对靛蓝胭脂红的脱色产物进行液质分析,结果如图5所示。在负离子检测模式下检测到靛蓝胭脂红脱色产物离子峰质荷比(m/z)为216.07[M-Na]-,推测该物质为4-氨基-3-羧基苯磺酸钠。目前,对靛蓝胭脂红降解产物的报道较少,有文献报道靛蓝胭脂红的降解产物是靛红-5-硫酸钠[15]。本试验检测到靛蓝胭脂红降解的另外一种产物可能是4-氨基-3-羧基苯磺酸钠。该鉴定结果说明,在CotA漆酶的催化作用下靛蓝胭脂红被降解成小分子化合物,靛蓝胭脂红被催化脱色降解。

图4 染料质量浓度和温度对脱色率影响的3D响应面(a)和等高线图(b)

图5 靛蓝胭脂红脱色产物液相质谱

3 结论

CotA漆酶能够催化靛蓝胭脂红脱色。影响CotA催化靛蓝胭脂红脱色的主要因素为温度、pH和染料质量浓度。对CotA漆酶降解靛蓝胭脂脱色条件进行了优化,建立了三元二次数学模型。该模型很好地拟合了靛蓝胭脂红的脱色率与各因素之间的关系。pH、温度、染料质量浓度3因素对脱色率的影响具有交互作用,其对脱色率影响的显著性由大到小依次为:pH、温度、染料质量浓度。根据试验实际情况得出的最优降解条件为pH=8.6、温度为60 ℃、染料质量浓度为41.5 mg·L-1,在该条件下靛蓝胭脂红脱色率可达91.4%,与模型预测值接近。CotA漆酶能够催化靛蓝胭脂红降解生成质荷比为216.07[M-Na]-的小分子化合物,靛蓝胭脂红被降解。

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Decolorization Optimization of Indigo Carmine by CotA Laccase//

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(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University,2016,44(9):106-111.

CotA; Indigo carmine; Decolouration; Response surface methodology

1)国家核设施及放射性废物治理科研项目(14ZG6101);科技部基础性工作专项项目(2014FY210400)。

范丽莉,女,1986年10月生,哈尔滨工业大学化工与化学学院,博士研究生。E-mail:357309136@qq.com。

王炎,哈尔滨工业大学化工与化学学院,教授。E-mail:wangy_msn@hotmail.com。

2016年4月22日。

Q554+.9

责任编辑:程 红。

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