宋昊 王白鹤 邵雪宝 程伟 熊竞舒 王小坡 王建 曾学思 徐秀莲 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科

CCL18在恶性黑素瘤中的表达及其与血管内皮生长因子、Ki67表达的相关性研究

宋昊 王白鹤 邵雪宝 程伟 熊竞舒 王小坡 王建 曾学思 徐秀莲 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科

目的探讨趋化因子配体18（CCL18）在恶性黑素瘤（恶黑）组织中的表达和临床意义，与血管内皮生长因子（VEGF）、Ki67表达的相关性。方法用免疫组化方法检测58例恶黑石蜡标本中CCL18、VEGF及细胞增殖核抗原Ki67的表达，同时检测20例色素痣石蜡标本中CCL18的表达水平。对CCL18的表达与恶黑临床病理及VEGF、Ki67的表达进行相关性分析。用免疫荧光方法验证CCL18在恶黑组织中的表达。结果CCL18在恶黑组阳性率为84.48%（49/58），而在色素痣组均无表达，差异有统计学意义（χ2=45.46，P＜0.01）。CCL18在恶黑的表达与肿瘤Clark分级、Breslow厚度呈正相关（rs值分别为0.609、0.644，均P＜0.01）；在有无溃疡以及有无淋巴结转移组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。CCL18的表达在不同性别、年龄、肢端/非肢端恶黑患者组间差异无统计学意义（均P＞0.05）。恶黑中CCL18阳性表达水平与VEGF表达水平呈正相关（rs=0.727，P＜0.05），与Ki67表达水平无相关（P＞0.05）。免疫荧光显示，恶黑组织中肿瘤细胞胞质表达CCL18。结论CCL18在恶黑组织中高表达，与肿瘤侵袭、转移有一定关系。

痣和黑素瘤；趋化因子CCL18；病理过程；血管内皮生长因子类；Ki⁃67抗原

趋化因子配体18（CCL18）是一种CC型趋化性细胞因子，主要由M2型单核/巨噬细胞或树突细胞分泌，可作为基本细胞因子维持机体稳态，其基因位于染色体17q11.2［1］。目前研究表明，淋巴及外周组织中单核细胞表达的CCL18可能促进炎症及病理状态下淋巴细胞及未成熟树突细胞的趋化，并影响上皮间质转化，与肿瘤的侵袭、转移相关［2⁃3］。CCL18因子在恶性黑素瘤（恶黑）中的作用不清楚，我们通过检测恶黑、色素痣组织中CCL18的表达，探讨CCL18在恶黑组织中的表达意义。

资料与方法

1.资料：2012—2015年中国医学科学院皮肤病医院经临床、组织病理学及免疫组化确诊的58例恶黑（包括原位黑素瘤15例，侵袭性黑素瘤43例，其中转移性黑素瘤5例）和20例色素痣石蜡标本。58例恶黑患者中，男26例，女32例；年龄26～86岁，平均59岁，其中20～59岁25例，60～86岁33例。病程0.3个月至8年。皮损位于肢端者45例，非肢端者13例。伴发溃疡者34例，不伴溃疡者24例。Clark分级Ⅰ～Ⅱ级29例，Ⅲ～Ⅴ级29例。Breslow厚度≤1 mm 14例，1～2 mm 13例，2～4 mm 23例，＞4 mm 8例。2例恶黑及对照正常皮肤新鲜组织标本取自2016年4月本院经临床、组织病理及免疫组化确诊并手术扩大切除的恶黑患者。

2.主要试剂：CCL18免疫组化抗体为浓缩型兔抗人多克隆抗体（英国Abcam公司）。血管内皮生长因子（VEGF）、Ki67均为即用型兔抗人单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。DAB酶底物显色试剂盒和即用型快捷免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。CCL18免疫荧光抗体为鼠抗人单克隆抗体（美国RD Systems公司）。免疫荧光二抗为Alexa Fluor®488标记山羊抗小鼠IgG（南京福麦斯生物技术有限公司）。

3.免疫组化法检测石蜡标本CCL18、VEGE、Ki67：石蜡切片脱蜡至水，65℃水浴孵育45 min至1 h脱色素柠檬酸/乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液高压修复6 min；滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜，滴加二抗，室温孵育15 min，3，3′⁃二氨基联苯氨四盐酸盐（DAB）显色，苏木精复染。磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，厂家提供已知阳性片做阳性对照。

4.免疫荧光法检测新鲜组织标本CCL18：新鲜组织冰冻切片经4%甲醛液固定10 min，Triton X⁃100通透15 min，免疫染色封闭液封闭1 h；滴加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，滴加二抗，室温孵育1 h，4′，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（DAPI）染色3 ～ 5 min。封片后激光共聚焦显微镜观察。

5.免疫组化结果判定：CCL18阳性表现为显微镜下细胞胞质棕黄色染色，在高倍镜（×400）下随机选择5个视野，根据阳性细胞所占的百分率及染色强度评分。阳性细胞百分率评分标准：不着色计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，＞50%计3分。染色强度评分标准：不着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，深褐色计3分。二项乘积得最终评分。最终评分：（-）计0分，（+）计1～ 3分，（++）计4～6分，（+++）计＞6分。VEGF阳性表现为胞膜或胞质棕黄色染色：根据染色强度分为4级：阴性（-），弱阳性（+），中度阳性（++），强阳性（+++）。Ki67阳性表现为胞核棕黄色颗粒沉着，取5个高倍（×400）视野，以阳性细胞所占细胞总数的平均值计算Ki67阳性率，分为4级：（-）为不着色，（+）为阳性细胞数 ＜ 5%，（++）为5% ～ 50%，（+++）为 ＞ 50%。结果由两名皮肤病理科医师独立阅片进行，每张组化切片均同时行HE染色对照。

6.共聚焦显微镜观察：样品在激光共聚焦显微镜（日本Olymplus公司）下扫描。胞核染色为蓝色荧光，CCL18阳性表达的胞质染色为绿色荧光，计算机采集数据并合成图像。

7.统计学方法：用SPSSl9.0统计软件进行数据统计分析，计数资料比较采用χ2检验，两组独立等级资料的非参数检验采用Mann⁃WhitneyU检验，等级资料相关性分析用Spearman相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.CCL18在恶黑组织及色素痣组织中的表达：CCL18在20例色素痣均无表达，在58例恶黑有49例有CCL18阳性表达（图1A），阳性率为84.48%，而且CCL18与人黑素瘤标志物Melan⁃A（T细胞识别黑素瘤抗原，图1B）在同一组织中的阳性分布一致。CCL18在恶黑组的表达明显高于色素痣组，差异有统计学意义（χ2=45.46，P＜0.01）。2例新鲜标本免疫荧光染色示CCL18在2例恶黑组织肿瘤细胞胞质阳性表达（图2A），而CCL18在2例正常皮肤组织中不表达（图2B）。

2.恶黑组织中CCL18与VEGF、Ki67表达水平的相关性：VEGF在恶黑标本中均存在不同程度的表达（图1C），Ki67在大部分恶黑标本中弱阳性或阳性表达（图1D）。CCL18表达水平与VEGF表达水平呈正相关（rs=0.727，P＜0.01），与Ki67表达水平无相关性（P＞0.05）。见表1。

图1 免疫组化检测恶性黑素瘤组织中蛋白表达（EnVision法×100） 1A：趋化因子配体18CCL18在肿瘤细胞阳性表达，胞质呈棕黄色；1B：T细胞识别黑素瘤抗原在肿瘤细胞阳性表达，胞质呈棕黄色；1C：血管内皮生长因子在部分细胞胞膜或胞质呈棕黄色染色；1D：细胞增殖核抗原Ki67在部分细胞胞核呈棕黄色染色 图2 免疫荧光染色检测皮肤恶性黑素瘤患者趋化因子配体18的表达2A：恶性黑素瘤组织中，CCL18在肿瘤细胞阳性表达，呈绿色荧光；2B：正常皮肤组织中，CCL18不表达

表1 恶性黑素瘤CCL18与Ki67、VEGF表达的关系

3.恶黑组织中CCL18表达水平与临床病理特征的关系：见表2。CCL18表达水平与恶黑Clark分级、Breslow厚度呈正相关（rs分别为0.609、0.644，均P＜0.01），在有无溃疡、有无淋巴结转移组间差异有统计学意义（均P＜0.05），有溃疡组CCL18表达水平高于无溃疡组，有转移组CCL18表达水平高于无转移组。而CCL18表达水平在不同性别、年龄、部位（肢端/非肢端）组间差异无统计学意义（均P＞0.05）。

讨 论

研究表明，恶黑组织中存在肿瘤相关巨噬细胞即M2型巨噬细胞，并与恶黑的侵袭和转移具有密切关系，发挥促癌作用［4］。CCL18是M2型巨噬细胞分泌的一种趋化性细胞因子，除了在炎症过程中激活和趋化白细胞，CCL18还在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达升高，参与上皮间质转化、促进血管生成，最终促进肿瘤的侵袭及转移。

目前对CCL18在恶黑发生发展中的作用尚无研究，辛崇美等［5］通过细胞学研究发现，CCL18有促进A375细胞侵袭的作用，并明显促进肿瘤血管生成，其表达提示恶黑获得更高的侵袭能力［6⁃7］。本研究结果显示，CCL18表达在恶黑组织中升高，与肿瘤Clark分级、Breslow厚度呈正相关，并在肿瘤形成溃疡或发生淋巴结转移的情况下CCL18表达增高，表明CCL18在恶黑中具有促进肿瘤侵袭及转移的促癌作用。

为了进一步评估CCL18与恶黑增殖、侵袭及转移的相关性，我们选取了与增殖相关的抗原Ki67以及与血管生成相关的抗原VEGF进行研究。有研究表明Ki67抗原与肿瘤的生长、浸润、转移等生物学行为密切相关［8］。VEGF能促进血管内皮细胞增殖、分裂，诱导肿瘤微环境中新生血管形成，并增加血管通透性，从而促进肿瘤生长和转移［9⁃10］。本文结果显示，在恶黑中CCL18的表达与Ki67的相关性不明显，表明CCL18对恶黑细胞的增殖活性可能无明显影响，但CCL18的表达水平与VEGF的表达有相关性，与辛崇美等［5］CCL18有促进肿瘤血管生成的研究，结果一致。说明CCL18在恶黑的血管形成中发挥重要作用。

表2 CCL18在恶性黑素瘤组织中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系

［1］Schutyser E,Richmond A,Van Damme J.Involvement of CC chemokine ligand 18（CCL18） in normal and pathological processes［J］.J Leukoc Biol,2005,78（1）:14⁃26.DOI:10.1189/jlb.1204712.

［2］Su S,Liu Q,Chen J,et al.A positive feedback loop between mesenchymal⁃like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell,2014,25（5）:605⁃620.DOI:10.1016/j.ccr.2014.03.021.

［3］Bonecchi R,Locati M,Mantovani A.Chemokines and cancer:a fatal attraction［J］.Cancer Cell,2011,19（4）:434⁃435.DOI:10.1016/j.ccr.2011.03.017.

［4］殷芳,吴飞,陈佳,等.肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响［J］.中华皮肤科杂志,2014,47（9）:619⁃623.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2014.09.003.

YinF,WuF,ChenJ,etal.Effects of tumor⁃associated macro⁃phages on the biological behavior of A375 human malignant melanoma cells［J］.Chin J Dermatol,2014,47（9）:619⁃623.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2014.09.003.

［5］辛崇美,李光,孙建方,等.CCL18趋化性细胞因子对A375黑素瘤细胞株增殖和侵袭的影响［J］.中华皮肤科杂志,2010,43（12）:833⁃836.

Xin CM,Li G,Sun JF,et al.Effects of chemokine CCL18 on the proliferation and invasion of a human melanoma celllineA375［J］.ChinJDermatol,2010,43（12）:833⁃836.

［6］Gao J,Li ZH,Tang W,et al.Chemokine C⁃C motif ligand 18 expression correlates with tumor malignancy in breast cancer［J］.Pathol Biol（Paris）,2015,63（4⁃5）:199⁃203.DOI:10.1016/j.patbio.2015.07.001.

［7］Wang Q,Tang Y,Yu H,et al.CCL18 from tumor⁃cells promotes epithelial ovarian cancer metastasis via mTOR signaling pathway［J/OL］.Mol Carcinog,2015［2016⁃1⁃4］.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mc.22419/full.［Publish online ahead of print Oct 12,2015］.DOI:10.1002/mc.22419.

［8］王宝娜,王翔,张增海,等.Ki67在乳腺癌中的表达及临床意义［J］.中华肿瘤杂志,2014,36（4）:273⁃275.

Wang B,Wang X,Wang J,et al.Expression of Ki67 and clinicopathological features in breast cancer［J］.Chin J Oncol,2014,36（4）:273 ⁃275.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253⁃3766.2014.04.007.

［9］Felcht M,Thomas M.Angiogenesis in malignant melanoma［J］.J Dtsch Dermatol Ges,2015,13（2）:125 ⁃136.DOI:10.1111/ddg.12580.

［10］Brychtova S,Bezdekova M,Brychta T,et al.The role of vascular endothelial growth factors and their receptors in malignant melanomas［J］.Neoplasma,2008,55（4）:273⁃279.

Expression of CC chemokine ligand 18 in cutaneous malignant melanoma tissues and its relationship with vascular endothelial growth factor and Ki67 antigen expressions

Song Hao,Wang Baihe,Shao Xuebao,Cheng Wei,Xiong Jingshu,Wang Xiaopo,Wang Jian,Zeng Xuesi,Xu Xiulian,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo measure the expression of CC chemokine ligand 18（CCL18）in cutaneous malignant melanoma（CMM）tissues,and to explore its clinical significance,as well as relationship with vascular endothelial growth factor（VEGF）and Ki67 antigen expressions.MethodsImmunohistochemistry was performed to measure CCL18,VEGF and Ki67 expressions in 58 paraffin⁃embedded CMM tissue specimens,as well as CCL18 expression in 20 paraffin⁃embedded pigmented nevus specimens,and immunofluorescence assay to confirm the expression of CCL18 in fresh CMM tissue specimens.Correlations of CCL18 expression with CMM clinicopathologic features,VEGF and Ki67 expressions were analyzed.ResultsCCL18 was detected in 49（84.48%）of 58 paraffin⁃embedded CMM specimens,but in none of the 20 paraffin⁃embedded pigmented nevus specimens,with a significant difference in the positive rate of CCL18 between the CMM group and pigmented nevus group（χ2=45.46,P＜ 0.01）.The expression of CCL18 in paraffin⁃embedded CMM tissues was positively correlated with Clark′s level and Breslow thickness of CMM（rs=0.609,0.644 respectively,bothP＜ 0.01）,and was significantly different between ulcerated and non⁃ulcerated CMM（P＜ 0.05）,as well as between patients with and without lymphatic metastasis（P＜ 0.05）.However,there were no significant differences in the expression of CCL18 among patients of different age,gender,or between acral and non⁃acral CMM（allP＞0.05）.In addition,the expression of CCL18 in CMM tissues was positively correlated with that of VEGF（rs=0.727,P＜ 0.05）,but unrelated to that of Ki67（P＞ 0.05）.Immunofluorescence assay showed CCL18 expression in the cytoplasm of tumor cells in CMM tissues.ConclusionCCL18 is highly expressed in CMM tissues,and may be involved in tumor invasion and metastasis.

Nevi and melanomas;Chemokine CCL18;Pathologic processes;Vascular endothelial growth factors;Ki⁃67 antigen

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

2016⁃01⁃29）

（本文编辑：尚淑贤）

徐秀莲，Email：xxlqjl@sina.com；孙建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.10.002

国家自然科学基金（81272992）；江苏省自然科学基金（BK2012505、BK20131063）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505,BK20131063）