刘宇鹏，余小燕，吴立红,刘瑞玉

(1.南方医科大学第二临床医学院,广州 510515；2.广东省惠州市中心人民医院检验中心　516001；3.广东医科大学检验系，广东湛江 524001)



·经验交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.029

惠州地区妇女宫颈感染高危型人乳头瘤病毒调查*

刘宇鹏1，余小燕2#，吴立红3,刘瑞玉2△

(1.南方医科大学第二临床医学院,广州 510515；2.广东省惠州市中心人民医院检验中心516001；3.广东医科大学检验系，广东湛江 524001)

目的研究高危型HPV-DNA检测负荷量与宫颈病变程度的相关性。方法分析2013年1月至2014年12月就诊于惠州市中心人民医院妇科(门诊和住院)并采用第二代基因杂交捕获法检测高危型HPV-DNA的患者9 917例，从中筛选出1 209例检测结果为阳性的患者，并同时行液基细胞学检查(TCT)。结果(1)9 917例样本中，HPV感染率12.19%，21～50岁年龄段感染率总体高于其他年龄段(P<0.05)。(2)1 209例高危型HPV-DNA阳性患者中，细胞学诊断：未见上皮内病变835例(69.07%)，炎性反应细胞改变179例(14.81%)，ASC 33例(2.73%)，LSIL 59例(4.88%)，HSIL 103例(8.52%)。将高危型HPV-DNA检测结果阳性负荷量分为1～100、101～300、301～600、601～1 000、>1 000 pg/mL组，看不同TCT结果的负荷量分布情况，可见每组的比率并不完全随宫颈病变的加重而呈递增趋势。(3)宫颈细胞学病变程度与HR-HPV-DNA负荷量相关系数r=0.245(P<0.01)。结论高危型HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度并不完全相符，高危型HPV-DNA负荷量并不能作为预测宫颈病变严重程度的指标。

人乳头瘤病毒；液基细胞学检查；高危型HPV-DNA负荷量；宫颈病变程度；第二代基因杂交捕获法

人乳头瘤病毒(HPV)与许多疾病有关，包括湿疣、Bowen氏病样丘疹及宫颈、阴道和外阴内上皮瘤病变和癌瘤[1]。宫颈癌约居女性最常见的癌症中第二位。全球每年的新发病例约52.98万，死亡病例约25.51万，85%发生在发展中国家[2]。研究认为高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是宫颈癌的主要致病因素，其中HPV16和HPV18是最常见的高危型别，70%～75%的浸润性宫颈癌与其有关[3]。目前，杂交捕获法Ⅱ(hybrid capture Ⅱ，HCⅡ)在临床上已经得到普及。HPV分型技术成为国内外的研究热点，而我国宫颈癌的发病率和死亡人数约占全世界1/3～1/4。HPV中引起高度病变的HR-HPV是公认的引起宫颈癌的危险因素[4-5]。检测宫颈HR-HPV已成为预防女性宫颈癌的关键之一。本文通过对9 917例14～96岁妇女行第2代基因杂交捕获技术(HC2-HPV-DNA)，从中筛选出1 209例检测结果为阳性的患者，并同时行液基细胞学检查(TCT)。两种方法联合检测,以研究本地区妇女HR-HPV感染与宫颈病变的相关性，现将检测结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料病例来源于2013年1月至2014年12月于惠州市中心人民医院妇科就诊的女性患者(包括门诊及住院)9 917例，年龄14～96岁，平均(36.6±5.2)岁，采用HCⅡ法进行高危型HPV-DNA检测，从中筛选出1 209例HR-HPV阳性、并同时行薄层液基细胞学检查的患者进行分析。

1.2仪器与试剂

1.2.1HPV-DNA高危型检测试剂盒(购自惠州市卫康中西药业有限公司)，采用HCⅡ-HPV-DNA检测法，按说明书操作，基因杂交捕获仪DML2000均购自美国Digene公司；指示剂染料、变性试剂、探针稀释剂、高危型HPV探针、低危型HPV质控样本、高危型质控样本、阴性对照、高危型HPV校准品、捕获酶标板、检测试剂1、检测试剂2和洗涤用缓冲浓缩液。

1.2.2液基细胞沉降式自动制片染色系统LBP-2601型购自广州安必平公司；试剂分别有细胞保存基液、细胞分离提取液、黏液稀释液、细胞黏附剂和抗凝剂。

1.3方法

1.3.1HR-HPV-DNA检测一次性检测13种HR-HPV-DNA(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型)，但不能单一分型。任何1种HR-HPV-DNA高于阈值均视为检测阳性。检测步骤:(1)碱性溶液破坏病毒DNA双链，释放并分解为核苷酸单链；(2)DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交复合体；(3)第一抗体(特异性抗体)将RNA-DNA杂交复合体固定在微孔壁上；(4)结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交复合体结合是信号放大；(5)碱性磷酸酶使酶底物发光，判读荧光强弱可确定碱性磷酸酶的水平从而确定RNA-DNA的水平；(6)结果判定，以标本的相对荧光光度值(relative light unit,RLU)与阳性定标阈值(cut off，CO)的比值表示，RLU/CO≥1.0 pg/mL为阳性，<1.0 pg/mL为阴性 。

1.3.2薄层液基细胞学检查将宫颈刷插入宫颈管，外侧毛刷抵住宫颈外口，力度适中的推向宫颈,并按顺时针方向旋转3～5圈。把宫颈刷取下放入装有保存液的小瓶中，标明患者姓名、年龄、取样日期(常温下能保存1个月)。经“振荡-不同转速离心两次-振荡-静置”后，置于自动制片机上制成片，制成的涂片用H-E染色，用中性树胶封片并干燥，显微镜下观察细胞改变。按宫颈细胞学报告结果命名(TBS)分级标准，宫颈病变分为良性反应性细胞改变和宫颈上皮内病变，宫颈鳞状上皮内病变包括：未明确意义的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells，ASC)、低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。

1.4统计学处理所有资料经SPSS17.0软件进行统计分析。采用多个样本率比较的χ2检验对不同年龄段HPV感染阳性率差别进行统计分析。采用多个独立样本比较的Kruskal-WallisH检验(秩转换的非参数检验)对HR-HPV阳性患者不同TCT组别的HPV-DNA负荷量的分布情况进行比较。另外，采用Spearman等级相关分析(线性趋势检验)对宫颈细胞病理病变程度与HR-HPV-DNA负荷量之间相关性进行分析，并计算等级相关系数(rs)，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1HPV感染率与年龄的关系9 917份患者样本中HR-HPV-DNA阳性1 209例，占12.19%；HPV感染年龄(37.4±10.2)岁，其中>20～50岁年龄段HPV(+)感染人数占总感染人数的90.32%。14～20岁和>60岁这两组HPV感染率最高，均大于21.05%，>20～60岁较低，占9.72%～16.78%，呈“正U字形”双峰分布，各年龄组间的HPV感染率差异有统计学意义(χ2=61.12,P<0.01)。由于14～20、>50～55、>55～60、>60岁这4组人数较少不便评价，其他各年龄组比较，经χ2检验，>20～50岁组间的HPV感染率差异有统计学意义(χ2=20.153，P<0.05)。见表1。

2.2不同级别宫颈细胞病理学改变与HR-HPV-DNA负荷量的相关性1 209例HR-HPV阳性患者中，未见上皮内病变(negative for intraepi-thelial lesion,NILM)者为835例(69.07%)，炎性反应细胞改变者为179例(14.81%)，ASC 33例(2.73%)，LSIL 59例(4.88%)，HSIL 103例(8.52%)。将HR-HPV-DNA检测结果阳性负荷量分为1～100、101～300、301～600、601～1 000、>1 000 pg/mL组，看不同TCT结果的负荷量分布情况。NILM 组、炎症组、ASC组、LSIL组和HSIL组的HPV病毒负荷量差异具有统计学意义(χ2=111.0，P<0.01)。TCT各组平均秩为NILM 组(563.15)，炎症组(576.2)，ASC组(714.62)，LSIL组(823.35)与HSIL组(834.04)间比较HR-HPV-DNA负荷量平均秩差异有统计学意义(P<0.05)，其负荷量平均秩从小到大排列顺序为NILM组、炎症组、ASC组、LSIL组、HSIL组。因此HR-HPV-DNA负荷量随宫颈病变的加重而呈递增趋势，HR-HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度并不完全相符。见表2。

2.3宫颈病变程度与HR-HPV-DNA负荷量相关性分析将宫颈细胞病理学检查结果NILM 组、炎症组、ASC组、LSIL组与HSIL组按病变分级程度与HR-HPV-DNA负荷量进行Spearman等级相关分析(线性趋势检验)，经χ2检验，线性回归分量差异有统计学意义(χ2=100.11,P<0.01)。等级相关系数rs=0.245(P<0.01)，说明HR-HPV-DNA负荷量与细胞病理学不同病变程度之间有一定相关性，但相关程度不显著。

表1　不同年龄HPV感染率

表2　高危型HPV阳性患者不同TCT组别的HPV-DNA负荷量的分布情况[n(%)]

3　讨　论

高危型HPV感染已成为当前最常见的性传播疾病，宫颈癌是妇科肿瘤中仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤，HPV已明确为宫颈癌的病因，因此HR-HPV 感染已逐渐受到人们的极大关注[6-7]。HR-HPV感染与宫颈癌的发生有直接的联系，由于HR-HPV感染引起的疾病通常有很长的潜伏期，如果能及早发现HR-HPV感染，并及时治疗，则可有效预防和控制宫颈癌的发生。目前,HPV筛查仍是预防和控制宫颈癌的主要手段。HCⅡ是目前唯一获美国FDA 认证的HPV-DNA检测方法，可以同时检测引起子宫颈癌的13个HR-HPV。是目前检测HR-HPV 感染的主要方法，也是筛查宫颈癌及癌前病变发生的重要指标[8]。采用HCⅡ检测HR-HPV 感染能直观发现宫颈疾病患者，还能筛选出其中的高危人群。

本文研究9 917例患者样本中HR-HPV-DNA阳性1 209例，占12.19%，其中21～50岁年龄段HPV(+)感染人数占总感染人数的90.32%。各年龄段HPV感染率，14～20岁和>60岁这两组最高均大于21.05%，>20～60岁这8组较低占9.72%～16.78%，呈“正U字形”双峰分布。结果与朱木华等[9]研究的结果相近。但由于14～20岁、>50～55、>55～60、>60岁这4组人数较少不便评价，所以根据HPV阳性率分析，>20～50岁年龄段为HPV-DNA阳性感染的优势年龄，这可能与该年龄段女性的性生活最活跃有关。

HPV-DNA病毒具有嗜上皮性、高度组织和宿主特异性，与多种人类肿瘤的发生相关，HR-HPV的持续感染是宫颈上皮恶性转化的最重要危险因素，它能使宫颈癌的发生风险提高250倍，是宫颈癌及癌前病变发生发展的必要条件,HPV感染检测已成为宫颈癌防治中必不可少的筛查内容[10]。HC-Ⅱ检测仅能相对半定量地报告HR-HPV的阳性或阴性，无法鉴别出具体的感染HPV的类型及是否为混合感染。在对HPV阳性的报告进行解读和对HPV阳性患者进行分流时常常给临床医生和HPV感染者带来一定的困惑，但是，HC-Ⅱ检测有着高度的敏感性和阴性预测值，作为HR-HPV的筛查具有重要意义[11]。

HCⅡ本质是基因杂交信号放大技术，无需基因扩增，属于线性级数放大。HCⅡ发现HSIL的灵敏度为95%，明显优于液基细胞学，但是特异度为85%，略低于液基细胞学。对于HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度是否正相关这一问题尚无定论，现已知的是HPV-DNA负荷量与治疗后的愈后有关。很多研究表明宫颈病变的演进与高危型HPV 持续感染有明显关系[12-13]。部分研究支持HPV-DNA的检出率随着宫颈病变的加重而增加这一观点[14]。有研究则发现HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度无显著相关性Andersson[15]应用PCR在176例CIN患者中检测了高危型HPV-DNA负荷，发现HR-HPV病毒负荷与CIN病变级别没有关系。喻垚等[16]对1 343例患者的统计数据表明，与病理组织结果对照，CIN超过Ⅰ期患者的HSIL和SCC以及HPV-DNA阳性率均较高，并且伴随着病变程度的增高，阳性率也随之增加。然而在HPV阴性患者中，有28%宫颈鳞癌患者，同时在小于或等于ASCUS中仍然也有少量的CINⅡ/Ⅲ，说明单独采用TCT或HPV 检测均有一定的漏检率。2种方法学比较，TCT 具有更高的灵敏度和阳性预测值，而HR-HPV检测具有较高的特异性和阴性预测值。2种方法联合检测其灵敏度、特异性、阴性预测值以及阳性预测值较单独检测均有不同程度的提高。

有研究显示，TCT检测假阴性率仅为0.26%，TCT采用特制颈管刷收集脱落的细胞，几乎保存了所有标本，经程序化处理后制成细胞涂片，固定染色后显微镜下阅片诊断，该法易于观察不正常细胞，且细胞核结构清晰，易于鉴定，大大降低了假阴性率，提高了灵敏度和特异性[17]。本文研究1 209例高危型HPV阳性患者中，未见上皮内病变(NILM)者为835例(69.07%)，炎性反应细胞改变者为179例(14.81%)，ASC 33例(2.73%)，LSIL 59例(4.88%)，HSIL 103例(8.52%)。经多个独立样本比较的Kruskal-WallisH检验(秩转换的非参数检验)，χ2=111.0，P<0.01。按α=0.05水准，可以认为不同TCT组别(NILM组、炎症组、ASC组、LSIL组和HSIL组)的HPV病毒负荷量差异具有统计学意义(平均秩)。NILM组、炎症组、ASC组、LSIL组与HSIL组间比较HR-HPV-DNA负荷量差异有统计学意义(P<0.05)，其负荷量(平均秩)从小到大排列顺序为NILM 组、炎症组、ASC组、LSIL组、HSIL组。将宫颈细胞病理学检查结果按病变分级程度与HR-HPV-DNA负荷量进行Spearman等级相关分析(线性趋势检验)，经χ2检验，线性回归分量差异有统计学意义(χ2=100.11,P<0.01)。等级相关系数rs=0.245(P<0.01)，提示HR-HPV-DNA负荷量与细胞病理学不同病变程度之间有一定相关性，但相关程度不显著。因此，HR-HPV-DNA负荷量并不完全随宫颈病变程度的加重而呈递增趋势，HR-HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度并不完全相符。HPV-DNA阳性的负荷量范围十分广，在ASC、LSIL和HSIL中HPV-DNA负荷量虽然分布重叠较大，但却无法定义高病毒负荷水平。

朱木华等[9]采用PCR方法和TCT检测方法对惠州地区7 796例流动人口育龄妇女HPV感染及宫颈病变的调查研究发现，HPV感染率7.29%，其研究主要感染类型为HPV16、58、52、18型，感染年龄以15～24岁人群最高，宫颈病变发生率及病程度随感染者年龄增加而增加，与本研究结果相近。

综上所述，不同年龄结构之间HR-HPV感染情况不同，且HR-HPV感染病毒负荷量和阳性率呈相关性。HR-HPV-DNA感染检出率具有年龄、地域、种族等也有差异性。通过TCT 和HR-HPV-DNA联合检测可提高宫颈病变诊断的准确性，降低漏诊率，做到早发现，早预防和治疗具有重要价值。HR-HPV-DNA的检出率可能随着宫颈病变程度的加重而增加，但HR-HPV-DNA负荷量并不完全随宫颈病变程度的加重而呈递增趋势，HR-HPV-DNA负荷量与宫颈病变程度并不完全相符，HR-HPV-DNA负荷量并不能作为预测宫颈病变严重程度的指标。

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广东省惠州市科技计划项目(2013y031)。作者简介：刘宇鹏(1993-)，本科，主要从事临床医学研究。#共同第一作者：余小燕(1973-)，副主任技师，本科，主要从事产前诊断研究。△

，E-mail:liuruiyu301@163.com。

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1671-8348(2016)26-3694-04

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2016-05-16)