苏会岚

(成都医学院公共卫生系，成都 610500)



·技术与方法·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.026

信号增强型电化学免疫传感器用于NT-proBNP高灵敏检测的研究*

苏会岚

(成都医学院公共卫生系，成都 610500)

目的构建用于人N末端前钠尿肽(NT-proBNP)高灵敏检测的电化学传感器。方法采用自组装方法将牛血清清蛋白-碳纳米管复合物(BSA- MWNTs)固载在洁净的玻碳电极表面，结合共价交联固定化技术和亲和素-生物素信号放大技术，制得NT-proBNP高灵敏免疫传感器，优化实验条件，采用电化学方法对电极的响应特性进行研究。结果在最优实验条件下，该传感器对NT-proBNP响应的线性范围为1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，检出限为0.03 ng/mL。结论该方法可实现对NT-proBNP的超灵敏检测。

电化学；免疫传感器；NT-proBNP；牛血清清蛋白；碳纳米管

N 末端前钠尿肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)，是从其氨基酸前体蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而来，含 76 个氨基酸的非活性多肽。研究证实，NT-proBNP能反映心脏功能损伤及损伤程度，目前已被作为心衰的一个特异性的疾病标志物在临床上广泛应用[1-3]。由于NT-proBNP在人血清中含量低，因此，建立一种高灵敏的NT-proBNP检测方法在心血管疾病的早期临床诊断中起着重要作用。NT-proBNP的常规检测方法主要有放射免疫分析、发光免疫分析、酶联免疫吸附试验，具有一定的灵敏度和特异性，但操作繁琐、耗时。而基于免疫技术与电化学检测相结合的免疫传感器技术可实现免疫分子的定量分析，且灵敏度高、分析速度快[4]。本研究通过将牛血清清蛋白-碳纳米管复合物(BSA-MWNTs)用于构建生物分子固载界面，通过共价键和固定化技术及生物素-亲和素信号放大技术，研制了一种 NT-proBNP的电化学免疫传感器，优化实验条件，并研究其响应性能。

1　材料与方法

1.1仪器CHI660电化学工作站(上海辰华仪器公司)，BRANSONIC200超声清洗仪(德国BRANSONULTRASCHALL公司)，MP230酸度计(瑞士Mettler-toledo公司)，AB204-S电子天平(瑞士Mettler-toledo公司)，格力冰柜，玻碳电极，微量进样器，烧杯若干，50mL容量瓶，玻璃棒，洗瓶等。

1.2试剂NT-proBNP、bio-anti-NT-proBNP、牛血清清蛋白(BSA)、链霉亲和素(SA)、多壁碳纳米管(MWNTs)、EDC、NHS，0.3 μm 的Al2O3粉末，实验室用水均为二次去离子水，铁氰化钾，亚铁氰化钾，pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS缓冲液等。

1.3NT-proBNP免疫传感器的制备

1.3.1测试底液[K4Fe(CN)6/ K3Fe(CN)6溶液]用电子天秤称取0.082 3 g的铁氰化钾和0.105 6 g的亚铁氰化钾于小烧杯中，加入pH=5.0的PBS缓冲溶液溶解，倒入50 mL容量瓶中，配成两者各5 mmol/L的混合溶液，备用。

1.3.2BSA-MWNTs复合物的制备MWNTs使用前用浓硝酸∶浓硫酸(3∶1)80 ℃处理5 h，水洗后真空干燥。取1 mL 0.25% BSA溶液于小烧杯中，向其中加入1 mg碳纳米管，振荡，超声半小时得到分散良好的BSA-MWNTs的复合物。

1.3.3EDC和NHS 交联剂的制备在电子天秤上称取0.06 g的NHS和0.08 g的EDC于50 mL的烧杯中，加入4 mL蒸馏水，用玻璃板搅拌使之完全溶解，即得EDC和NHS 各约10 mmol/L的交联剂(此交联剂不可久置)。

1.3.4MWNTs传感器的制备首先，在1.0、0.3 μm 的Al2O3糊中将玻碳电极(GCE)表面抛光，用蒸馏水超声清洗数次，最后室温晾干。其次，将10 μL BSA-MWNTs复合物滴涂于经预处理的电极表面，室温晾干，再将其浸泡在EDC/NHS 溶液中，2 h之后将电极于4 ℃下与链霉亲和素(sa)反应5 h，再与生物素标记的anti-NT-proBNP(bio-anti-NT-proBNP)反应2 h。最后在0.25% BSA中封闭1 h，制得NT-proBNP传感器。将电极置于4 ℃的冰箱中保存待用。电极制备过程示意图，见图1。

图1　免疫传感器的修饰过程示意图

1.4检测方法利用循环伏安法(CV)对电极的制备过程进行表征，检测过程中饱和甘汞电极为参比电极，Pt电极为对电极，玻碳电极为工作电极，电极表征在5 mmol/L K3Fe(CN)6+5 mmol/L K4Fe(CN)6+ 0.1 mmol/L KCl + 0.1 mmol/L PBS(pH=7.0)的溶液中进行；循环伏安法电位区间为-0.2～0.6 V，扫描速率为50 mV/s。

2　结　果

2.1不同修饰电极的电化学表征用循环伏安法研究电极在制备过程中的电化学特性，其结果见图2。图中曲线a为裸电极的循环伏安表征图，可以观察到一对氧化还原峰。曲线b为BSA-MWNTs复合纳米材料修饰的玻碳电极的表征图，从图中可以看到，氧化还原峰电流均有降低，说明该复合纳米材料成功的固载在电极表面。由于亲和素、生物素、anti-NT-proBNP、BSA等生物分子都具有电化学惰性，因此曲线c、d、e、f的氧化还原峰电流均有不同程度的降低，响应电流降低的幅度和生物分子的大小有一定相关性。综上可证实：该免疫传感器得以成功构建。

a:GCE;b:BSA-MWNTs/GCE;c:sa-EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;d：bio-anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;e:BSA/bio--anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;f:NT-proBNP/BSA/bio--anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE。

图2电极修饰过程的循环伏安图

2.2实验条件的优化

2.2.1测试底液pH的选择测试底液 pH 会影响电极电子传递效率及敏感膜的稳定性，不适宜的pH还会影响生物分子的活性,导致蛋白质间的亲和力降低，从而影响免疫分子的结合效率及免疫复合物的稳定。本研究分别用pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS缓冲液配制的K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6为测试底液，用循环伏安法测试不同 pH 值下免疫电极的循环伏安曲线，从图中得出不同pH值下的峰电流值(图3)，其中当pH为7.0 时，氧化还原峰电流均达到最大值。故本文选择 pH 7.0 的 PBS 作为测试底液。

图3　pH对峰电流的影响

图4　孵育时间对峰电流的影响

图5　孵育温度对峰电流的影响

2.2.2NT-proBNP孵育时间的选择免疫反应完成的程度与反应时间有关，将修饰有抗体的免疫电极放入50 ng/mL抗原溶液中，反应不同时间(5、10、20、30、35、40 min)，用循环伏安法测定其响应峰电流的变化，其结果见图4。结果表明，反应30 min时，响应电流趋于稳定，表明免疫反应已经完成。故实验过程中选择的最佳孵育时间为30 min。

2.2.3NT-proBNP孵育温度的选择温度是影响免疫反应的一个重要因素，本实验在20～45 ℃范围内考察了温度与反应信号的关系，抗原的孵育时间均为30 min 。结果表明随着温度从20～45 ℃升高，响应峰电流减小，说明抗原和抗体反应的程度逐渐增加。在温度较低时(20～30 ℃)，生物分子的活性较低，免疫反应效率低，且不利于电极的稳定性。随着温度逐渐升高，免疫反应效率不断提高，但温度过高也会引起蛋白质变性而失活，减少使用寿命。因此，本研究选择孵育温度为35 ℃，见图5。

2.2.4免疫传感器的响应特性在最优实验条件下，分别测定了该免疫传感器对不同浓度(1、3、5、8、10、20、30、50、80、100、150 ng/mL)NT-proBNP的响应，见图6。当溶液中的抗原和电极表面的抗体特异性结合后，生成的免疫复合物为高电阻物质，阻碍了修饰电极表面的电子传输，致使响应电流下降。NT-proBNP浓度越高，敏感膜上生成的免疫复合物越多，响应电流下降就越明显。结果显示：NT-proBNP线性范围为1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，斜率分别为1.462 88和197 57，检出限为0.03 ng/mL(性噪比3∶1)。

图6　NT-proBNP抗原浓度与峰电流的线性关系

2.2.5免疫传感器的选择性研究为了考察该传感器的选择性，实验同时制备6支相同的免疫传感器，将传感器于30 ng/mL 的BSA、CEA、PSA、HRP和10 ng/mL的NT-proBNP混合溶液孵育30 min，传感器电极编号1、2、3、4、5、6的响应电流(I)与干扰物质存在时的响应电流(I1)之间的差值△I分别为0.021、0.014、0.019、0.031、0.028、0.030 μA，说明该传感器选择性良好。

2.2.6免疫传感器的重现性研究本研究还通过同时制备6支相同的传感器来考察该传感器的重现性。通过将这6支免疫传感器在相同条件下孵育相同浓度抗原后行电化学检测，电极编号1、2、3、4、5、6响应电流分别为55.421、55.312、55.425、55.586、55.313、55.521 μA，相对标准偏差为10.98%，表明该传感器重现性良好。

图7　NT-proBNP电化学免疫传感器与ELISA法血清样本检测结果相关性分析

2.2.7临床应用使用本研究提出的高灵敏NT-proBNP电化学免疫传感器检测了40例临床血清标本，同时采用ELISA法进行平行试验，两种方法的线性相关性为0.994 72(图7)。

3　讨　论

电化学免疫传感器是将抗原抗体间的特异性识别作用与电化学分析方法结合，通过免疫反应前后电化学信号的变化而实现对目标分子的检测。与临床上现有的化学发光法相比，电化学免疫传感器具有检测速度快、响应稳定、操作简便、成本低等优势，在疾病标志物高灵敏检测方面得到广泛应用[5-9]。

生物分子的固定化是免疫传感器制备过程中的关键技术之一，是否能有效保证生物分子的活性关系到检测结果可靠性。本实验中采用BSA分散的MWNTs作为固定化基质，应用BSA的良好生物相容性[10-11]，结合生物素和生物素的固定系统，可有效保证电极表面固定化抗体的生物活性，这一结论通过对传感器制备过程的表征得以证实。由于NT-proBNP在健康人血清中含量低，免疫传感器的灵敏度是能否准确检出NT-proBNP的关键。MWNTs具有良好的导电性能及大的比表面积，有效提高电极比表面积的同时可增强电极表面的电子传输能力[12-13]。本研究中将MWNTs掺杂到BSA中，可有效提高电极表面的电子传输效率，增强电流响应信号。同时，本研究还将生物素-亲和素系统引入修饰电极中，可有效提高抗体的固载量，提供更多的免疫结合位点[14-15]，增强免疫传感器的检测灵敏度。

为了使传感器的性能最佳，研究中对实验条件进行了优化，实验结果表明，测试底液pH7.0、孵育温度35 ℃、孵育时间30 min为传感器的最佳工作条件。在最优实验条件下，该免疫传感器对NT-proBNP响应良好，线性范围为1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，检出限为0.03 ng/mL(S/n=3∶1)，表现出线性范围宽、灵敏度高的特点。健康人血清中的NT-proBNP含量通常为0.1 ng/mL，心衰时可升高到2～3 ng/mL，该传感器的线性范围宽和灵敏度高，可以满足实际血清样品检测需求。另外，本研究对免疫传感器的选择性和重现性的研究结果表明，该免疫传感器抗干扰能力和重现性能优良，可用于实际检测。同时，将该免疫传感器与ELISA进行临床实际样品的检测对比，二者检测结果的线性相关性好，说明免疫传感器能准确检出血清样本中的NT-proBNP。而普通ELISA的检测时间长，该免疫传感器在检测时间上有明显优势，更适于临床快速检测。

综上所述，本研究提出的电化学免疫传感器具有良好的响应性能，具有线性范围宽、灵敏度高、操作简单、成本低等优点，可实现NT-proBNP的高灵敏检测，对心血管疾病患者的早期诊断提供了新的技术支撑。

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Research on the signal enhanced electrochemical immunosensor for the detection of NT-proBNP*

Su Huilan

(DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan610500,China)

ObjectiveTo construct an electrochemical immunosensor for detection NT-proBNP with high sensitivity.MethodsThe proposed immunosensor was prepared by the follows:firstly,the hybrid material BSA- MWNTs was self-assembled onto the surface of cleaned glass carbon electrode;subsequently,streptavidin was covalently linked to the modified electrode;then,biotin labeled antibody could be absorbed to the electrode by the reaction between streptavidin and biotin.The effects of experimental paramenters have been investigated.ResultsUnder the optimal experiment conditions,the prepared immunosensor displayed a wide liner relationship between 1-30 ng/mL and 30-150.0 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL.ConclusionThe NT-proBNP imunosensor can be utilized for the detection of NT-proBNP with low concentration.

electrochemistry;immuno-sensor;NT-proBNP;bovine serum albumin;carbon nanotube

国家自然科学基金资助项目(81401757)。作者简介：苏会岚(1986-)，讲师，博士，主要从事疾病标志物的快速检测方法的研究。

R446.61

A

1671-8348(2016)26-3684-04

2016-03-11

2016-05-26)