蔡文倩,童　静,胡晞江,冷　培

(武汉市妇女儿童医疗保健中心生殖医学实验室　430016)



联合应用荧光原位杂交与核型分析在产前诊断的对比研究

蔡文倩,童静,胡晞江,冷培

(武汉市妇女儿童医疗保健中心生殖医学实验室430016)

目的探讨荧光原位杂交(FISH)和核型分析技术在产前诊断中的优势和不足。方法在B超引导下抽取150例孕妇的羊水，用特异性探针GLP13/21和CSP18/X/Y对未培养的羊水细胞进行原位杂交；同时培养羊水细胞进行核型分析，并结果对比。结果150例羊水细胞核型分析和FISH检测结果均成功。核型分析报告时间为10～15 d，而FISH仅为2 d。150例羊水细胞，染色体非整倍体46例，结构异常7例。FISH检测出非整倍体45例，敏感性97.83%；未能检测出1例X染色体部分缺失及其他结构多态性；无假阳性结果，特异性保持在100.00%。结论FISH可以快速、准确地诊断胎儿染色体数目异常，但判断结构异常仍需核型分析。

原位杂交，荧光；染色体；核型分析；产前诊断；非整倍体

产前诊断染色体病是降低胎儿出生缺陷，提高人口素质的重要措施之一。培养羊水细胞进行传统的染色体核型分析，是确诊染色体病的重要手段，被国内外誉为诊断染色体病的金标准。但羊水细胞进行核型分析亦存在耗时长、易污染、操作繁杂、阅片困难的问题。荧光原位杂交技术以其快速、准确、灵敏度高、特异性强等优势，在产前诊断中得到越来越广泛的应用[1-2]。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术于20世纪80年代发展起来，其原理是将已知单链DNA序列作为探针，直接标记荧光素，再与靶DNA进行杂交。通过荧光显微镜观察杂交后的荧光信号，对待测标本中相应核酸进行分析[3]。FISH技术于1988年被考虑应用于临床，如今在基础生物学领域和临床研究领域得到了广泛的应用[4-6]。目前，市场上已有专门用于FISH检测13、18、21、X和Y染色体的试剂盒。与传统染色体核型分析方法比较，FISH技术免去了细胞培养和核型分析的复杂过程，能快速、准确诊断80%的常见的染色体异常，特别适用于产前诊断。

1　资料与方法

1.1一般资料受检者均为2013年10月至2015年10月在本院产科门诊检查并有产前诊断指征，无羊膜腔穿刺术禁忌证的孕妇，共150例。孕妇年龄18～44岁，平均(29.5±5.7)岁，妊娠17～22周。受检孕妇产前诊断指征如下：孕妇年龄大于或等于35岁，血清唐氏生化筛查高风险，无创基因筛查高风险，不良孕产史，孕妇或其夫染色体多态性，超声检查胎儿异常等。羊膜腔穿刺术禁忌证包括：穿刺时具有先兆流产症状者，腋下体温高于37.5 ℃，凝血功能检查有异常，有急性盆腔或宫腔感染征象，并且无明显指征的单纯性别鉴定。所有孕妇均签署知情同意书。

1.2羊水穿刺在超声引导下行经腹羊膜腔穿刺术。抽取羊水27 mL，丢弃最初2 mL羊水，以减少母体细胞污染的机会。其中10 mL×2用于羊水培养行染色体核型分析，5 mL羊水直接用于FISH检测。FISH技术诊断结果与核型分析结果进行比较。所有羊水及时送检、及时处理。

1.3染色体核型分析方法所抽取羊水进行无菌操作。按照产前诊断技术行业标准和规范，将两管各约10 mL的羊水样本，2 000 r/min离心8 min，弃上清液，得细胞沉淀，分别加入Gibco 羊水培养基5 mL，轻轻吹散细胞，混匀后接种于2瓶细胞培养瓶中，分别置37 ℃、5% CO2培养箱中独立培养。根据细胞生长状况，细胞培养5～7 d贴壁后换液，约2 d后瓶底有大量透亮的圆细胞时加秋水仙素终止培养，酶消化收获贴壁细胞，经离心、低渗、固定后制成细胞悬液，制片显带后使用美国VideoTesT-Karyo3.1全自动染色体分析系统按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2013年)》标准进行染色体核型分析。平均每例分析20个中期分裂象，分析3～5个克隆的染色体，每个克隆分析配对一个分裂象，并保存核型图。报告时间大约需要2～3周。

1.4FISH技术检测方法

1.4.1探针应用应用北京金菩嘉医疗科技有限公司生产的GLP 13/GLP 21位点特异性探针及CSP 18/CSP X/CSP Y染色体着丝粒特异性探针对5 mL未培养羊水直接进行FISH检测。

1.4.2羊水细胞预处理及制片羊水细胞5 mL，2 000 r/min离心8 min，弃上清液；低渗、固定细胞，制片。

1.4.3探针杂交制片完成后，将玻片酶消化，乙醇脱水处理，然后于暗室杂交探针，将玻片置于杂交盒75 ℃水浴，杂交5 min；立即将玻片从杂交盒中拿出，转入湿盒，42 ℃温箱过夜；翌日，洗涤玻片以除去未杂交探针，并DAPI染色；10～20 min后观察。

1.4.4阅片计数于荧光显微镜下观察细胞及荧光信号。镜下观察，选择细胞核核膜完整，背景干净，核内杂交信号明亮清晰无重叠的细胞进行细胞及荧光信号计数。人工计数细胞核中的荧光信号，每个杂交区常规性的计数50个细胞。某指标正常细胞大于90%,提示该指标正常；某指标异常细胞大于60%，提示该指标异常；介于两者之间应当加大计数，如实记录异常细胞比例。

2　结　果

2.1细胞培养核型分析结果150例羊水均培养成功，报告时间10～15 d。150例产前诊断者羊水染色体检测中，染色体数目异常者46例，其中21三体36例(含标准型34例，易位型2例)，18三体8例，X染色体缺失嵌合体1例，X染色体部分缺失1例；染色体结构异常7例，其中平衡易位3例，罗伯逊易位2例，倒位2例。受检样本中无13号染色体异常和Y染色体异常。

2.2FISH检测结果150例羊水FISH检测操作均在取样后2 d内完成。150例产前诊断者FISH检测中，羊水结果异常者45例，其中21三体36例，18三体8例，其结果与染色体核型分析结果相符(图1)；1例X(52%)/XX(48%)，其对应的染色体核型分析为45,X[17]/46,X,+mar[3]，因FISH技术自身限制，其判读结果不能作为嵌合体诊断。但有1例X染色体部分缺失，FISH方法未能检测出。受检样本中无13号染色体异常和Y染色体异常。

A：21三体羊水细胞(21三体/13正常)；B：正常羊水细胞(13/21)；C：18三体羊水细胞(18三体/XX)；D：性染色体缺失(18/XO)羊水细胞；E：正常羊水细胞(18/XY)。GLP13探针定位于人类13号染色体长臂(13q14)，杂交信号为绿色(FITC)；GLP21探针定位于21号染色体长臂(21q22)，杂交信号为橘红色(Rbodamine)。CSP 18探针定位于18号染色体18p11.1-q11.1，杂交信号为天蓝色(DEAC)；CSP X探针定位于X染色体X p11.1-q11.1，杂交信号为绿色(FITC)；CSP Y探针定位于Y染色体Y p11.1-q11.1，杂交信号为橘红色(Rbodamine)。细胞核由DAPI染色，为蓝色。

图1羊水细胞FISH检测图

2.3核型分析与FISH检测结果比较将染色体核型分析结果与FISH检测结果对比。FISH技术检测迅速，结果判读直观；FISH技术检测出染色体非整倍体异常与核型分析结果一致；但FISH技术未能检测出染色体结构变异或多态性(图2)。受检样本中，34例标准型21三体和8例标准型18三体，FISH技术全部检测出；2例易位型21三体，FISH技术亦能检测出，但其异位情况则不能得知。在53例染色体异常中，18、21和X非整倍体46例，占胎儿全部染色体异常的86.79%(46/53)，荧光原位杂交检测出了45例异常(表1)。因此，由荧光原位杂交检测染色体18、21和X非整倍体的敏感性97.83%(45/46)，特异性100.00%。

表1　羊水培养核型分析检出结果与FISH检出结果对比(n)

续表1　羊水培养核型分析检出结果与FISH检出结果对比

a：该样本FISH技术检测出21号染色体为三倍体异常，但未能检测出异位。

A:典型21三体羊水细胞的核型分析与FISH结果；B:染色体结构异常图。

图2染色体核型分析与FISH结果

3　讨　论

染色体数目变异主要源自双亲一方的配子形成时或妊娠初期受精卵卵裂时出现染色体不分离现象，导致该染色体增多或减少一条[7]。大部分染色体数目异常胚胎由于基因剂量效应无法发育成熟，仅有部分染色体异常的胚胎可以存活。

临床常见的常染色体数目异常遗传病是唐氏综合征(21三体综合征)，爱德华综合征(18三体综合征)，帕陶综合征(13三体综合征)，性染色体数目异常遗传病有特纳综合征(典型核型45,X)，克氏综合征(典型核型47,XXY)。患者往往存在生长发育、智力及生殖方面的严重缺陷[8-9]。

胎儿遗传物质的核型分析是产前诊断染色体病的金标准。孕早期绒毛活检，孕中期羊膜腔穿刺获取羊水及脐静脉穿刺是目前获取胎儿遗传物质进行细胞遗传学分析的重要手段。其中，孕中期羊膜腔穿刺取羊水安全简便、可行性强，在产前诊断中得到广泛应用。羊水细胞中含有不同类型的组织细胞，主要有胎儿肾细胞与胎儿上皮细胞。妊娠16～22周，子宫已超出盆腔，易穿刺取得羊水且羊水中活细胞比例高[10]。培养羊水细胞进行核型分析，可全面观测染色体数量及结构，直观分析染色体缺失或易位。但细胞培养取材多、耗时长、易污染，结果判读要求高，增加孕妇的焦虑。

近年来，也有临床上应用微阵列-比较基因组杂交(array CGH)技术和核苷酸多态性微阵列(SNP array)技术检测胎儿基因组，虽然分辨率高、易于自动化、特异性强，但成本高、结果判读要求高、不能检测出染色体平衡易位，未能在临床广泛推广[11]。另外，应用高通量测序技术从母体血浆中富集胎儿游离DNA并检测染色体非整倍体，无创安全，易于自动化，具有重大的潜在意义，但技术仍不成熟，缺乏充分的临床实践及证据，只能作为精确筛查技术，而不宜夸大其在产前诊断中的作用[12]。

现今，在产前诊断环节中，最常见的胎儿染色体异常发生在常染色体21、18、13和性染色体X、Y，约占产前诊断中有临床意义染色体异常的80%。加强对13、18、21和性染色体数目异常的检测，能有效控制胎儿先天性疾病及出生缺陷。

FISH技术在临床上具有广泛的应用。FISH技术检测150例受检羊水，均在48 h内完成报告；检测出36例21三体(34例标准型和2例易位型)和8例18三体。与传统细胞培养核型分析相比，FISH技术耗时短、灵敏度与特异性高、不受污染干扰、操作简单、人工判读结果快捷，有效提高了临床报告的效率，减轻受检孕妇及家属的焦虑，并为后续治疗提供及时且有效的诊断依据，实现了染色体异常的快速诊断[13]。FISH技术不仅应用于羊水样本的检测，对绒毛和脐血样本也能做出快速且准确的诊断。据国内外文献报道，FISH技术准确性、灵敏性较高，用于染色体非整倍体的产前诊断稳定可靠[5,13]。

但FISH技术也有其局限性。FISH技术不能得知2例易位型21三体样本的易位情况，因此不能适用于染色体结构异常的检测。FISH探针结合位点为相应染色体着丝粒处，对染色体结构异常(如倒位、易位、重复、部分缺失、着丝粒融合)等无法识别。虽然平衡易位等不一定导致明显的临床症状，但携带者在生育时可能会有遗传影响[14]。而且，据文献报道，易位型21-三体因染色体着丝粒融合，可能导致常规FISH检测中出现假阴性[15]。有1例X染色体部分缺失样本FISH技术未能检测出。因为CSP X探针定位于X染色体X p11.1-q11.1，如果缺失的部分并非分布此处，则探针信号显示完整，部分缺失不能被检测出。所以要排除胎儿染色体结构异常，仍需要借助细胞遗传学技术来完成。另外，应用FISH技术诊断染色体嵌合体较为棘手。FISH 能够检出部分嵌合体，但由于存在信号丢失和杂交效率等影响，不能作为嵌合体的判读。FISH技术诊断染色体结构异常及染色体嵌合体需要结合染色体核型分析。

综上所述，FISH技术对染色体非整倍体检测快速高效，而核型分析对染色体结构异常准确可靠。FISH技术联合核型分析是优势互补的检测方式，在羊水标本产前诊断中发挥越来越重要的作用。

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Prenatal diagnosis for chromosome aneuploidies in 150 amniotic fluid samples with fluorescence in situ hybridization and karyotype analysis

Cai Wenqian,Tong Jing,Hu Xijiang,Leng Pei

(LaboratoryofReprolluctiveWuhanWomenandChildrenMedicalCareCenter,Wuhan,Hubei430016,China)

ObjectiveTo investigate the Clinical Assessment of fluorescence in situ hybridization and karyotype analysis in prenatal diagnosis.Methods150 amniotic fluid specimens were collected from women with pregnancy 18 to 22 weeks by amniocentesis,and amniocytes were detected by both karyotype analysis and FISH for rapid diagnosis at the same time.Chromosome probe GLP13/21 and CSP18/X/Y were used in the FISH detection with the results of chromosome karyotype.ResultsAll of the 150 amniotic fluid specimens were detected successfully in only 2 days by FISH,while those by chromosome karyotype were detected in 10-15 days.A total of 46 cases with abnormal chromosome and 11 cases with polymorphism in chromosome structures by chromosome karyotype.FISH detection checked out 44 cases with trisomy and 1 case for mosaic 45,XO/46,XX，those were consistent with the chromosome karyotype.1 case of X-excalation and 7 cases with polymorphism in chromosome structures could not be judge.Compared with the results of karyotype analysis,the Sensitivity of FISH in aneuploid was 97.83%,and the specificity of which was 100%.ConclusionCompared with traditional karyotyping,FISH for prenatal diagnosis showed rapid and high specific characters.FISH could be used to detect fetal chromosome aneuploid diseases,but could not determine the structural abnormality of chromosome.FISH technology could not replace karyotyping completely.

in situ hybridization,fluorescence;chromosomes;karyotyping;prenatal diagnosis;aneuploidy

蔡文倩(1985-)，主管技师，博士，主要从事遗传疾病及产前诊断的研究。

论著·临床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.020

R714.55

A

1671-8348(2016)26-3662-03

2016-03-18

2016-06-16)