杨　华，刘学英，杨风琴，楚元奎

(宁夏医科大学临床医学院医学检验学系，银川 750004)



论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.005

甲酰肽受体shRNA稳定转染U87细胞系的构建*

杨华，刘学英，杨风琴，楚元奎△

(宁夏医科大学临床医学院医学检验学系，银川 750004)

目的构建靶向甲酰肽受体(FPR)基因的shRNA 慢病毒表达载体，建立稳定转染的U87细胞系。方法设计并合成FPR基因特异性的shRNA序列，构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体，通过脂质体转染293T细胞包装成FPR慢病毒颗粒，感染U87细胞。荧光显微镜观察转染效果，实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测FPR干扰效率。结果成功构建FPR基因shRNA慢病毒表达载体。稳定转染U87细胞后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白。实时荧光定量PCR及Western blot证实PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体具有良好的干扰效果。结论成功构建FPR shRNA稳定转染的U87细胞系。

慢病毒属；甲酰肽受体；短发夹RNA；U87细胞

甲酰肽受体(formyl peptide receptor,FPR)属于G-蛋白偶联受体家族，在机体的炎症反应和天然免疫进程中起重要的作用。N-甲酰化甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leueyl-phenylalanine,fMLF)和来源于肿瘤细胞或其他宿主细胞线粒体的一些多肽，均能通过与FPR结合，进而介导恶性肿瘤细胞的迁移和增殖，在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用[1-2]。RNA干扰(RNA interence，RNAi)可特异性地阻断靶基因表达，是研究基因功能的有效技术。本实验设计构建并鉴定表达FPR基因的RNA 干扰靶点慢病毒载体，为进一步研究FPR在恶性肿瘤生物学行为中的影响及可能的作用机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料PDS019_pL/shRNA/GFP慢病毒载体购于上海诺百生物科技有限公司。EcoRⅠ内切酶、BsmbⅠ内切酶和T4DNA ligase均购自Fermentas公司。质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Ayxgen公司。大肠埃希菌STBL3 菌种购自TaKaRa公司。LipofactamineTM2000及包装质粒Packaging Mix购自Invitrogen 公司。293FT与U87细胞均由上海诺百生物科技有限公司提供。DMEM、胎牛血清(FBS)均购自HyClone公司。Opti-MEM购自Gibco公司。Trizol Reagent、QuantScript RT Kit、RealMasterMix(SYBR Green)均购自天根生化科技(北京)有限公司等。

1.2方法

1.2.1shRNA序列设计与合成在GenBank 中查找人类FPR的基因序列(NM_001193306.1)，其序列全长为1 371 bp，其编码序列(coding sequences，CDS) 位于147～1 199 bp。在线软件设计并合成3对参数最好的干扰靶序列(表1)。

表1　FPR-shRNA引物序列

1.2.2慢病毒表达载体的构建和鉴定PDS019_Pl/shRNA/GFP载体经BsmbⅠ和EcoRⅠ两种内切酶双酶切后切胶回收，并将退火后的3对shRNA序列与胶回收产物进行连接，连接产物转化感受态细胞，对生长出的克隆用菌检PCR方法检测，然后挑取阳性克隆测序验证。

1.2.3慢病毒载体的包装及滴度测定将包装质粒Packaging Mix和3种慢病毒表达质粒加入Opti-MEM混匀后与LipofectamineTM2 000共转染293T细胞，48 h后收集细胞培养上清液并浓缩，-80 ℃保存。浓缩上清液感染HEK293细胞，荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量。取荧光细胞数最少的2个培养孔的平均数值，分别计算滴度后取其平均值即为该病毒液滴度。病毒滴度为表达荧光的细胞数/该孔稀释的病毒液相当于原病毒的体积。

1.2.4实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting system,RT-qPCR)检测慢病毒FPR基因干扰效率病毒侵染293细胞48 h后，收集细胞。Trizol提取各组细胞的总RNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，按试剂盒操作说明合成第1 链cDNA，最后以cDNA为模板进行RT-qPCR检测，分析干扰效果，并确定最优干扰慢病毒。引物序列为FPR上游引物：5′-GGG TGA TGG CTC TGC TCC TC -3′；下游引物：5′-CGT TGG TCC AGG GCG AAA -3′；β-actin 上游引物：5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT -3′；下游引物：5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′。

1.2.5重组慢病毒感染U87细胞及稳转细胞系的筛选培养U87细胞至对数生长期，按照孔5×105个细胞接种于6孔板，培养过夜后感染病毒。以合适的MOI的病毒液侵染靶细胞，培养4～6 h后更换新鲜的完全培养基，继续培养24～72 h，根据细胞状态开始进行BSD(浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12 μg/mL)筛选，筛选10 d，建立稳转细胞系。

1.2.6RT-qPCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测稳转细胞FPR基因的表达收集筛选成功的稳转细胞，提取总RNA及总蛋白，RT-qPCR及Western blot检测FPR基因在U87细胞中的表达情况。

2　结　果

2.1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表达载体的序列鉴定将阳性表达载体进行DNA序列测定，测序结果与实验设计的合成的FPR靶基因序列完全一致。结果表明，合成的寡核苷酸片段成功插入到慢病毒载体PDS019_Pl/shRNA/GFP中，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表达载体构建成功(图1)。

2.2shRNA慢病毒包装和滴度测定3种PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒质粒转染293FT细胞24 h后，荧光显微镜下可见大部分细胞表达绿色荧光蛋白(图2)。3种PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒滴度分别为1.3×109、1.1×109、1.3×109TU/mL。

2.3RT-qPCR结果分析RT-qPCR数据结果显示慢病毒侵染293T细胞48 h后，干扰效果均大于90%，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1慢病毒表达质粒的干扰效果最好。

2.4稳转细胞系的构建与鉴定感染时将病毒按不同MOI数加入到U87细胞中，MOI=30～60时感染效率最好。用4 μg/mL BSD维持筛选建立稳转细胞系，荧光显微镜下可见荧光强度达90%以上(图3)。提取细胞总RNA及总蛋白后行Q-PCR及Western blot检测。结果显示，干扰稳转细胞系中FPR基因及蛋白表达水平均低于对照组(图4)，证明稳转细胞系构建成功。

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1表达载体测序；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2表达载体测序；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3表达载体测序。

图1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表达载体测序结果

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3。

图2荧光显微镜观察慢病毒包装(×100)

A:PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR；B:PDS019_Pl/shRNA/GFP-NC。

图3荧光检测FPR蛋白在U87细胞中的表达(×100)

A：RT-qPCR检测FPR基因表达结果；B：Western blot检测FPR蛋白表达结果。

图4FPR在U87细胞中的表达

3　讨　论

甲酰肽受体属于G-蛋白偶联受体家族，由FPR1、FPR2(FPRL1)和FPR3(FPRL2)3个成员组成[3]。在氨基酸组成上，FPR1与FPR2具有69%的同源性，FPR1与FPR3的同源性为56%[4]。FPR作为G-蛋白偶联受体家族，能够被不同结构的配体激活，包括肽、蛋白质和脂质。FPR与激动剂结合后，能够触发胞内信号级联参与调节血管生成，细胞增殖，防止凋亡等[5-6]。fMLF是一种分泌的病原体相关分子模式(pathogen-associated-molecular patterns,PAMPs)，在细胞损伤后，可以诱导中性粒细胞和单核细胞的趋化作用[7]。fMLF作为FPR的激动剂，能介导胶质瘤细胞的趋化移动[8]。在神经胶质瘤中，FPRs可能通过自分泌或旁分泌方式与局部刺激相互作用，在促进血管生成和肿瘤生长方面起到非常重要的作用[9-10]。而且，FPR1可以反式激活EGFR，二者共同作用促进神经胶质母细胞瘤的恶性表型[10-11]。膜联蛋白1(annexin 1,AnxA1)是FPR、FPRL1和FPRL2 3种受体的激动剂[12]，可通过激活FPRs促进胶质母细胞瘤的生长[13]、结肠直肠癌(SKCO-15细胞)的浸润能力[14]。Cheng等[15]的研究也表明，AnxA1能够通过FPR激活ERK/ITGB1BP1通路促进胃癌细胞的侵袭。而且在AnxA1过表达的胃癌组织中FPR1的表达显著增加，是影响胃癌患者总体生存的独立危险因素[16]。FPR在恶性肿瘤发生、发展和转移中的作用越来越备受关注，有望成为肿瘤治疗的新靶点之一。

为进一步研究FPR在肿瘤发生、发展及转移中的作用，本实验以FPR基因为靶基因，应用RNAi技术，设计3种针对FPR基因的特异性shRNA序列，构建3对慢病毒干扰载体。经PCR鉴定阳性克隆及DNA测序证实合成的寡核苷酸片段成功插入PDS019_Pl/shRNA/GFP，且插入片段与设计的靶序列一致，因此确定本实验成功构建了3种针对FPR基因RNA干扰靶点慢病毒载体。慢病毒包装后可成功转染至293T细胞中，通过RT-qPCR证实，设计包装的3种序列的慢病毒载体均可明显干扰293T细胞中的FPR基因表达，其中PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1序列沉默表达效果最佳。本研究成功构建FPR基因慢病毒干扰载体，并建立了FPR shRNA稳定转染的U87细胞系，为进一步研究FPR在人胶质瘤中的作用及作用机制奠定了实验基础。

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Construction of U87 cell line transfected by FPR shRNA*

Yang Hua,Liu Xueying,Yang Fengqin,Chu Yuankui△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,ClinicalMedicineSchoolofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo construct shRNA lentiviral vector for FPR gene,and establish stable transfection of U87 cell lines.MethodsThe shRNA sequences for FPR gene was synthesized and inserted into PDS019 lentiviral vector.Liposome was used to package PDS019 lentiviral particles into 293T cells and used to infect U87 cells.The green fluorescent protein (GFP) and the silencing effects of the recombinant vectors were detected with the fluorescence microscope and Q-PCR,Western blot.ResultsThe recombinant vectors were successfully constructed.In the U87 cells transfected with the recombinant vectors,the expression of GFP were detected and the interference efficiency of the recombinant vectors were confirmed.ConclusionThe constructed FPR shRNA lentiviral vectors could interfere the expression of FPR in U87 cells.

lentivirus;FPR;shRNA;U87 cells

国家自然科学基金资助项目(81301499,81460324)。作者简介：杨华(1974-)，副教授，博士，主要从事肿瘤发生的分子机制及临床作用研究。△

，E-mail:chuyuankui@163.com。

R730.2

A

1671-8348(2016)26-3616-03

2016-02-14

2016-04-06)