沈　平，苏齐鉴，黄毅毅，蒋丽萍，张达燕，郭继昌，徐鸿庄，韦建立

(1．广西壮族自治区钦州市钦南区疾病预防控制中心　535000；2.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011)



·论著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.002

钦州市钦南区HIV-1流行亚型及基因变异特征研究*

沈平1，苏齐鉴2△，黄毅毅1，蒋丽萍1，张达燕1，郭继昌1，徐鸿庄1，韦建立1

(1．广西壮族自治区钦州市钦南区疾病预防控制中心535000；2.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011)

目的调查流行于钦南区的HIV-1亚型种类并分析其基因变异特征。方法抽取100例未抗病毒治疗的HIV-1感染者，从血样中提取病毒RNA或前病毒DNA，采用聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1 gag基因和pol基因片段并测序，用系统进化树分析其亚型，并计算gag和pol区的基因离散率。结果97份血样获得gag基因序列或pol基因序列，4份血样的gag与pol分型不一致，其他93份分型明确，其中CRF01_AE重组型、CRF07_BC重组型、CRF08_BC重组型及G亚型分别占76.34%(71/93)、9.68%(9/93)、12.90%(12/93)和1.07%(1/93)。CRF08_BC的gag基因离散率为0.059±0.005，高于CRF07_BC的0.053±0.005(P<0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P<0.01)。CRF01_AE的pol基因离散率为0.044±0.003，高于CRF07_BC的0.035±0.004(P<0.01)和CRF08_BC的0.033±0.003(P<0.01)。结论钦南区HIV-1存在至少3种流行亚型，其中CRF01_AE是最主要的亚型，不同基因区的变异程度有所不同。

HIV-1；基因,gag；基因,pol；亚型；离散率；变异

自2010年起，广西实施的为期5年的艾滋病攻坚工程已初显成效，研究显示2008～2013年新报告的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、艾滋病患者呈现出先上升后下降的趋势，而晚发现比例仍然呈逐年上升趋势[1]。虽然广西新报告的艾滋病病例在2011年之后有所下降，但是此下降趋势在钦州市的某些地区并不明显[2]。钦州市是广西北部湾沿海正在建设的新兴城市之一，交通便利，艾滋病的流行因素广泛存在，艾滋病防治形势严峻。为了解该地区的HIV-1分子流行病学特征，本研究以钦州市钦南区未治疗艾滋病感染者为研究对象，对HIV-1的 gag和pol基因进行分析，探讨流行于该地区的HIV-1亚型，并分析其基因变异情况。

1　资料与方法

1.1一般资料在艾滋病综合防治数据管理系统中查询钦南区所有未经抗病毒治疗的HIV感染者，在查询到的361例中，利用随机数字表抽取100例，辖区内12个乡镇均有病例被抽中。对抽中的研究对象进行流行病学资料并抽取外周静脉血10 mL。

1.2方法

1.2.1病毒核酸提取分离血浆和血细胞，保存于-80 ℃冰箱。用RNA 提取试剂盒 (high pure viral RNA kit，Roche公司产品)从血浆中提取病毒RNA。当PCR扩增或测序失败时，用全血基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱公司)由血细胞提取前病毒DNA。

1.2.2gag和pol区基因序列扩增前病毒DNA通过巢式PCR分别扩增gag和pol基因，RNA经逆转录后进行巢式PCR。gag和pol区扩增引物及反应条件参照文献[3-4]。

1.2.3扩增产物鉴定与测序第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，对出现目的条带的PCR扩增产物进行DNA测序，其中，gag区产物送北京天一辉远生物公司测序，pol区产物送至北京博迈德生物公司进行测序。

1.2.4序列亚型分析与系统进化树分析序列经拼接、校正，用在线亚型分析工具Genotyping(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/)对序列进行亚型分析，用 MEGA 5.03 软件构建邻接系统进化树(重复运算 1 000 次)分析亚型和计算基因离散率(碱基替代模型为Kimura-2 parameter model)，进化树拓扑结构用Bootstrap法检验。gag和pol区参考序列来自HIV Database(http://www.hiv.lanl.gov)。

1.3统计学处理所有数据用SPSS 16.0进行处理。不同亚型基因离散率的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1流行病学资料3例研究对象的血样因严重溶血而排除，最后纳入97例。研究对象年龄9～89岁，其中20～49岁占62.8%；男性占67.0%；异性性传播占86.60%；职业以农民、工人及民工为主。CD4细胞计数平均为每微升415个。见表1。

表1　研究对象的流行病学资料

2.2基因亚型鉴定及分布在97份血样中，获得72株HIV-1的gag基因序列和95株HIV-1的pol基因。对序列进行Genotyping分型及进化树验证(图1、2)，规定某样本在gag基因和pol基因的分型中一致，或仅在1个基因测得其分型，则可确定其分型，若两基因分型不一致则不进行进一步分析。结果4份血样gag基因分型与pol基因分型不一致，其他93份血样Genotyping分型明确(表2)，其中，CRF01_AE占76.34%(71/93)，CRF07_BC占9.68%(9/93)，CRF08_BC占12.90%(12/93)，G亚型占1.07%(1/93)。本研究获得的G亚型毒株(QN100)与在广西发现的首例G亚型毒株(G.CN.2008.GX_2084_08.JN106043)成簇，Bootstrap达100%。

图1gag基因序列的系统进化树分析

图2pol基因序列的系统进化树分析

表2　HIV-1基因亚型分布

2.3基因离散率CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC在gag及pol区的离散率见表3。经方差分析，gag基因离散率差异有统计学意义(P<0.01)；SNK检验显示，CRF08_BC的gag基因离散率大于CRF01_AE(P<0.01)和CRF07_BC(P<0.01)。3种重组型的pol基因离散率的差异也有统计学意义(P<0.01)；SNK检验显示，CRF01_AE的离散率大于CRF07_BC(P<0.01)和CRF08_BC(P<0.01)。

表3　HIV-1 gag基因及pol基因的基因离散率

a：q=9.79，P<0.01，与CRF01_AE比较；q=4.61，P<0.01，与CRF07_BC比较。b：q=11.62，P<0.01,与CRF07_BC比较；q=16.09，P<0.01,与CRF08_BC比较。

3　讨　论

据文献报道，截至2009年，我国HIV-1流行亚型最多的是CRF01_AE(占30%)[5]。CRF01_AE也是近年来广西最主要的流行亚型，所占比例超过70%[6-8]。本次调查发现钦南区有CRF01_AE重组型(76.34%)、CRF07_BC重组型(9.68%)、CRF08_BC重组型(12.90%)和G亚型(1.07%)，亚型分布特点与广西其他地区相似。从历年的监测数据来看，CRF01_AE所占的比例在广西地区呈逐步上升的趋势。经分析，CRF01_AE的广泛流行可能与其Gp120蛋白独特的N连接糖基化位点分布有关，该毒株的N连接糖基化位点(PNGSs)总数量尤其在V2和V4区的数量明显较其他亚型的毒株少，而V5区的N连接糖基化位点数量又明显更多[9]。N连接糖基化具有维持Gp120蛋白的三级结构和回避宿主免疫攻击的作用，并且有可能影响HIV-1病毒的传染性[10-11]。

经查阅文献发现，G亚型在国内较为罕见，只有个别报道[12-13]。2008年广西发现的G亚型感染病例是北海市的1例静脉吸毒者[14]；本研究中发现的唯一1例G亚型样本与该毒株形成一簇，Bootstrap达100%。根据流行病学调查资料，本研究发现的G亚型感染病例及其配偶未曾在北海发生过高危行为，提示G亚型可能已经在北海和钦州的某些人群中小范围流行。

系统树分析发现4份样本的gag和pol基因区分型结果不一致。其中，QN005的gag区为CRF08_BC亚型，pol区为CRF01_AE区；QN058的gag区为CRF07_BC区，pol区为CRF08_BC；QN068的gag区为CRF07_BC区，pol区为CRF08_BC区；QN073的gag区为CRF07_BC区，pol区为CRF01_AE区。考虑到HIV-1高度的变异性和活跃的重组特性，分型的不一致可能是由于所感染的毒株发生了新的重组。

基因离散率分析通过计算序列间的变异程度来估计HIV-1在当地流行时间的长短。本研究发现，在gag区，CRF08_BC的基因离散率高于CRF07_BC和CRF01_AE，而在pol区，CRF01_AE的基因离散率高于CRF07_BC和CRF08_BC。两基因区离散率不一致的原因有待进一步分析，不排除两个基因区得到的序列数量不一致对此造成的影响。本研究的pol基因区离散率分析结果与王敏连等[15]的研究相吻合，目前各种证据比较倾向于CRF01_AE是广西流行时间最早的HIV-1毒株之一，而且目前已经成为不同传播途径的最主要流行亚型。

本次调查覆盖了辖区内所有乡镇，而且各乡镇的民族构成、生活方式和地方习俗等，以及影响艾滋病流行的因素基本一致，因此，抽取的样本有较好的代表性。本次调查获得了钦南区HIV-1分子流行病学特征的第一手资料，为追溯当地艾滋病的流行史和演变趋势，了解艾滋病的流行现状，以及为今后开展HIV-1流行监测提供了基础数据，这对于当地的艾滋病防控工作有重要的指导作用。

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HIV-1 subtype distribution and genetic variation in Qinzhou South district of Qinzhou city*

Shen Ping1,Su Qijian2△,Huang Yiyi1,Jiang Liping1,Zhang Dayan1,Guo Jichang1,Xu Hongzhuang1,Wei Jianli1

(1.QinzhouSouthDistricCenterforDiseasePreventionandControl,Qinzhou,Guangxi535000,China;2.AffiliatedRuikangHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning,Guangxi530011,China)

ObjectiveTo investigate HIV-1 subtypes circulating in Qinzhou South District and understand the features of genetic variation of the virus.MethodsBlood samples were collected from 100 HIV-1 antiretroviral treatment(ART)-patients from Qinzhou South District of Qingzhou city.Viral RNA and proviral DNA was extracted and amplified.The gag and pol gene fragments of HIV-1 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and were sequenced,then phylogenetic tree was constructed and genetic distance was calculated for each genetic region.ResultsGag or pol gene sequences were successfully amplified from blood samples.4 samples had different subtyping results in the two genetic region.There were 76.34% of CRF01_AE(71/93),9.68% of CRF07_BC(9/93),12.90% of CRF08_BC(12/93) and 1.07% of subtype G(1/93).The genetic distance of the gag gene for CRF08_BC was 0.059±0.005，higher than CRF07_BC (0.053±0.005,P<0.01) and CRF01_AE (0.049±0.004,P<0.01).But in the pol gene,the distance for CRF01_AE was 0.044±0.003,higher than CRF07_BC (0.035±0.004,P<0.01) and CRF08_BC (0.033±0.003,P<0.01).ConclusionThere are at least three subtypes circulating in Qinzhou South District,and CRF01_AE is the most predominant strain.The levels of genetic variation are different in the two genetic regions.

HIV-1;gene,gag;gene,pol;subtype;genetic distance;variation

国家自然科学基金资助项目(81360258)；钦州市钦南区科技局资助项目(20140101)。作者简介：沈平(1956-)，主任医师，本科，主要从事流行病学研究。△

，E-mail:agansue@163.com。

Q786

A

1671-8348(2016)26-3605-03

2016-02-21

2016-05-06)