冯　卫，李冬松，臧俊亭，付　莉

(1.吉林大学第一医院 骨关节科，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 妇产科)



不同方法处理的异种骨材料的生物力学比较

冯卫1，李冬松1，臧俊亭1，付莉2*

(1.吉林大学第一医院 骨关节科，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 妇产科)

目的比较不同处理方法对异种骨材料生物力学的影响。方法新鲜猪肋骨制成1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm大小，随机分成4组，A组为H2O2处理部分脱蛋白组，B组为深低温冷冻组，C组为深低温冷冻酶消化组，D组为新鲜异种骨移植，作为对照组。各组分别进行轴向压缩和三点弯曲试验。结果在轴向压缩试验中，D组最大，其次为C组、B组，A组最大载荷最小，明显小于其他各组(P<0.05)，最大应力和弹性模量D组、C组和B组没有明显差别(P>0.05)，而A组最大应力和弹性模量明显低于其他各组(P<0.05)。在三点弯曲试验中，最大载荷和弹性模量B组、C组和D组没有明显差别，A组最大载荷和弹性模量明显低于其他各组(P<0.05)。结论部分脱蛋白组对异种骨的生物力学影响最大，而深低温冷冻和酶消化法对异种骨的生物力学影响较小，是保存异种骨生物力学的良好的方法。

异种；移植；骨；生物力学

(ChinJLabDiagn,2016,20:1442)

骨移植是目前临床常见的组织移植[1]，尤其在创伤骨科和关节翻修等领域应用更加广泛，据统计全世界每年约有200万例病人接受骨移植手术用于修复骨缺损[2]。尽管自体骨具有最佳的骨传导、骨诱导和成骨能力[4]，但自体骨移植骨量少，需要增加新的手术切口，感染风险增加。同种异体骨移植同样也面临着来源短缺，存在病毒传播和免疫排斥反应的风险[5]。异种骨移植是目前有望替代自体骨移植和同种异体骨移植的有效方法之一。本研究通过不同方法处理内江猪骨，并观察处理后的骨材料的力学性能变化，比较不同处理方法对异种骨生物力学性能的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料的制备

近交系雄性猪，50 kg，无菌条件下取新鲜肋骨，剔除骨膜和周围软组织，取肋骨中段，保留一侧骨皮质，制成1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm大小的骨材料。

1.2实验分组及异种骨处理

根据异种骨的不同处理方法，将上述实验材料分为4组：

A组(H2O2处理部分脱蛋白组)：冲洗去除骨髓和血细胞，95%乙醚浸泡24小时脱脂，冲洗12小时，0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2，含NaN310 mmol/L)37℃孵育72小时，37℃，20% H2O2处理48小时，每12小时换液1次，-20℃冷冻保存。

B组(深低温冷冻组)：冲洗去除骨髓和血细胞，95%乙醚浸泡脱脂24小时，冲洗后液氮冷冻4月，-80℃深低温继续冷冻1月。

C组(深低温冷冻酶消化组)：冲洗去除骨髓和血细胞，95%乙醚脱脂24小时，冲洗，液氮冷冻处理4月，-80℃深低温保存1月。梯度缓慢复温，37℃水浴条件下，0.25%胰蛋白酶和100 U/ml的α-Gal糖苷酶分别消化48小时和72小时。

D组(对照组)：冲洗骨髓腔，新鲜异种骨材料作为对照，-20℃冰箱保存。

1.3材料的力学检测

各组骨材料分别进行生物力学检测，检测内容包括轴向压缩试验和三点弯曲试验，上述试验均在INSTRON 8874生物力学测试系统下完成。压缩试验和三点弯曲试验的加载速度分别为0.5 mm/min和5 mm/min。

1.4统计分析

SPSS19.0统计软件分析处理数据，各组间数据比较采用方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

2　结果

2.1各组骨材料轴向压缩测试结果

最大载荷各组比较，D组最大，其次为C组、B组，A组最大载荷最小，明显小于其他各组(P<0.05)，而最大载荷B、C、D组间无明显差别(P>0.05)。最大位移各组比较，A组、B组和C组间无明显差别(P>0.05)，D组明显高于其他各组(P<0.05)。在最大应力和弹性模量方面各组比较，A组明显小于其他各组(P<0.05)，而B组、C组和D组间无明显差别(P>0.05)，见表1。

表1　各组材料压缩生物力学比较±s)

2.2各组骨材料三点弯曲测试结果

最大载荷和弹性模量方面，B组、C组和D组间无明显差别(P>0.05)，A组明显小于其他各组(P<0.05)。最大应力方面，D组应力最大，其次依次为C组、B组和A组，各组间差别明显(P<0.05)，D组最大应力明显高于其他各组(P<0.05)。最大位移方面，B组和C组无明显差别(P>0.05)，而与其他各组间比较差别明显(P<0.05)，见表2。

表2　各组材料三点弯曲生物力学比较±s)

3　讨论

为了解决自体骨移植和同种异体骨移植来源短缺的问题，异种骨移植被认为是目前最为有效的方法之一，而猪作为异种移植理想的供体已经得到广泛的关注[4]。异种骨移植同样需要克服免疫排斥反应，而在不同的异种骨处理过程中会降低异种骨的传导性能[1]。

骨的基本组成是羟基磷灰石和Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原占骨的有机成分90%，羟基磷灰石的含量决定了骨的硬度和强度，而胶原的含量决定了骨的韧性[6,7]。目前去除异种骨抗原的处理方法主要包括脱脂去蛋白、物理深低温冷冻、酶消化等方法。

H2O2作为化学氧化剂直接影响骨的结构蛋白，可以有效降低异种骨的免疫排斥反应，但异种骨的生物力学强度也随之下降[8]。本试验中，采用20%H2O2处理的异种骨材料轴向压缩中最大载荷最小，仅为对照组新鲜异种骨的21.92%，同时在轴向压缩试验中的最大应力和最大应变也最小。同样在三点弯曲试验中，经H2O2处理的异种骨材料最大应力和最大应变也最小，与其他各组比较差别明显(P<0.05)。文献报道骨的力学强度与H2O2处理的时间呈反比[9]，本研究结果也表明采用20%H2O2处理过的异种骨材料生物力学性能显著下降。

有研究认为深低温冷冻会增加骨的脆性[10]，但Kang[11]研究认为反复冻融对骨的生物力学性能影响不大，经深低温冷冻处理的异种骨材料力学性能无明显改变[12]。本研究中经深低温冷冻处理的异种骨材料，其弹性模量、最大位移、最大载荷等接近新鲜对照组，结果显示深低温冷冻对异种骨的生物力学无明显影响。

与H2O2强氧化剂不同，酶水解过程温和，可以去除异种骨表面抗原，且对骨的生物力学影响较小[13]。本研究中在深低温冷冻降低异种移植免疫排斥反应的基础上，希望采用作用温和的胰蛋白酶和α-Gal糖苷酶进一步去除异种骨移植抗原，降低异种骨移植免疫排斥反应，结果表明经上述处理后的异种骨材料的生物力学性能接近于新鲜对照组，明显优于经H2O2处理的脱脂部分脱蛋白方法。

综上所述，在轴向压缩和三点弯曲实验中，脱脂部分脱蛋白法对异种骨的生物力学影响最大，而深低温冷冻和酶消化法对异种骨的生物力学影响较小，是未来保存异种骨生物力学的一种有效方法。

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Biomechanical Comparison of Xenogeneic Bone Material Treated with Different Methods

FENGWei,LIDong-song,ZANGJun-ting,etal.

(TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveThe aim of this study was to compare the influence of different treatment methods on the biomechanical characteristics of porcine bones.MethodsFresh ribs of pig were cut into 1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm specimens,which were randomly divided into four groups:group A by degreasing and partial deproteinization,group B by cryopreservation,group C by cryopreservation and enzyme digestion and group D was a control group using fresh bone.Axial compression and three point bending tests were performed for all groups.ResultsIn axial compression test,values for maximum load were:group D>group C>group B>group A.The maximum load of group A was significantly lower than that of the other groups (P<0.05).There was no difference among group D,group C and group B for the maximum stress and elastic modulus(P>0.05),The maximum stress and elastic modulus of group A were significantly lower than those in the other groups(P<0.05).In three point bending test,the maximum load and elastic modulus of group B,group C and group D were not significantly different (P>0.05).Maximum load and elastic modulus of group A was significantly lower than that of the other groups(P<0.05).ConclusionThe results indicated that xenogeneic bone treated with degreasing and partial deproteinization had the worst biomechanical properties.Cryopreservation and cryopreservation with enzyme digestion had little effects on the biomechanical properties,that means cryopreservation with or without enzyme digestion maybe a useful method to preserve the biomechanical properties of bone xenograft.

xenogeneic;transplantation;bone;biomechanics

吉林省科技厅课题(20160101131JC)；吉林省卫生和计划生育委员会课题(2015Z031)

1007-4287(2016)09-1442-03

R687.3+4

A

冯卫(1973-)，医学博士，副教授，吉林大学第一医院骨关节外科，主要研究方向为骨生物材料及关节外科。

2015-07-22)