陈颜嫣 张振强

（河南中医学院 河南郑州 450002）

线栓法制备大鼠脑缺血模型的要点和体会

陈颜嫣 张振强*

（河南中医学院 河南郑州 450002）

目的：提高线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血模型的成功率。方法：从鼠种、鼠龄、性别、侧别方面选择大鼠，分离颈总、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈总、颈外动脉，用鱼线和指甲油的改良线栓法制备线栓，经由颈总动脉剪一小口，将制备好的栓线插入颈总动脉，并推送入颈内动脉。根据大鼠体重和施术者手感选择合适的进线深度，阻断大脑中动脉，制备模型，并观察大鼠脑组织的病理改变。结果：造模成功率明显提高，模型符合脑梗死的病理过程。结论：改良后的方法模型成功率提高，可复制性强。

大鼠 脑缺血 鱼线线栓

动物实验造模是关键。近年来国内外报道了很多制备局灶性脑缺血动物模型的方法。1989年Longa开创了尼龙线栓法插入颈内动脉制成大脑中动脉脑缺血模型。本实验结合临床实际制备永久性脑缺血模型，在经典的线栓法基础上改进取得了满意的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠的选择

1.1.1.1鼠种的选择 SD大鼠解剖结构简单，分离血管难度小造模时出血量少。脑梗死体积稳定，易饲养繁殖，对损伤及外界刺激耐受性强等优点作为脑梗塞大鼠的首要选择。［1］此外大鼠分布于左侧颈部的迷走神经直接分布与心脏，分离血管时易损伤神经，对鼠的生命安全带来威胁。所以尽量选择右侧入路。［2］此法较正中切口，易行肌肉分离，视野暴露好。降低解剖难度和危险系数。［3］

1.1.1.2鼠性别的选择

鼠行为的不对称性和性别有关。ROSS［4］等观察刚出生的雌性大鼠鼠尾偏向右侧，而雄性鼠则无此差异。雌性激素对脑损伤也有保护作用，对鼠机体耐受性，行为不定性有一定的干扰。为避免雌性鼠的尾偏性和雌激素对脑梗塞后神经功能评分影响，脑梗塞模型选择雄性大鼠。［5］

1.1.1.3鼠龄、体重的选择

因脑梗塞多发于老年人群，但老龄大鼠的MCA发生了不同程度的迂曲，血管壁变脆，内膜的基底膜增厚、断裂或分层，对手术的耐受性也明显降低［6］。所以鼠龄选择仍以青年健壮的为宜。大鼠的体重与MCA的粗细及长度呈正相关，体重大于350g，颅内血管增粗，难以充分阻断MCA血流［7］；体重小于240g，血管纤细线栓难以插入。理想体重大鼠以240-300g之间为宜［8］。

1.1.2 线栓的准备

剪下5cm长一段鱼线，在1.8-2.0cm的地方做标记，把距标记1. 8-2.0cm的头端插入指甲油中制作一个光滑的栓子，晾干备用。260-300g体重大鼠选择直径0.28mm的鱼线，240-260g体重大鼠选择0.265mm的鱼线。

1.2 方法

1.2.1 线拴法制备大鼠脑缺血模型

术前12h须禁食，可自由摄水。高血糖条件下，脑缺血再灌注后脑组织梗塞面积及神经功能缺损症状会显著加重，死亡率明显增加。［9］

大鼠根据实验要求随机分组称重后，麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，消毒手术区。第一；分离血管。在颈部剪一5mm左右竖形切口，用眼科镊子小心分离组织，仔细钝性分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。第二；打三个结。颈外动脉打死结。在颈总动脉上距y型分叉1. 5cm处、打死结阻断血流。在颈总动脉Y型分叉0.5cm处打一个活结。颈内动脉暂用血管夹夹毕闭。第三；剪口。在颈总动脉的两根结扎线间，手术剪与血管成45度角剪一楔形小口，口越小越好。此时会有少许血液流出是正常现象。第四；插线。迅速把鱼线带栓子一头弧度方向朝上插入剪口处，左手把颈外动脉的结扎线向外拉使颈内动脉、颈总动脉处于一条直线上，右手用眼科镊把鱼线顺着血管走行方向插入颈内动脉。第五；控制进线深度。当至颈内动脉时，颈总动脉上活结打成死结。松开夹闭颈内动脉的血管夹，推动标记点到达y型分叉处。此时要特别注意手感，若有落空感，即表明线栓头端已插入大脑中动脉。

造模后伤口撒青霉素粉，层层缝合。仰卧位于干净鼠笼中，60w白炽灯距30cm照射，保证大鼠苏醒温度。过夜应将温度保持在25度左右。［10］线栓入分叉约1cm左右时，经常会感觉阻力，是线栓穿颅时遇到狭窄所致，强行推入易损伤血管，应将线栓退至切口处，调整方向重新插入.［11］盲目多次进退，损伤或刺激血管内皮细胞引起某些活性物质释放激发血栓，造成动物存活率下降。

1.2.2 造模成功的评价

动物苏醒后两小时评分，评分参照Longa 5级评分法进行神经功能评分［12］

0分：无体征；1分：动物左侧前肢不能完全伸展；2分：左前肤瘫痪，出现追尾现象；3分：肢体瘫痪，不能站立；4分：动物昏迷，无自主性活动。

按照实验要求1-2分的动物表示造模成功。

脑梗塞的金标准是TTC染色法，四氮唑红（2，3，5-trephenylte trazolium chloride，TTC）是一种水溶性盐，与活细胞线粒体内脱氢酶反应，生成深红色脂溶性物质。正常组织染成均匀的深红色，而梗死组织不着色，为苍白色。

图1 大鼠脑组织TTC染色

2 结果

经过我们多次试验反复摸索，舍弃了文献中的用玻璃胶和火烧法制造鱼线栓子。［13］探索出了用指甲油做栓子，指甲油价格低廉，性能稳定，短时间内不易脱落；我们总结了三结一夹的方法，颈外动脉死结，颈总动脉先近心端死结远心端活结，颈内动脉血管夹，然后鱼线从活结和死结间剪口进颈总后，活结变死结，最后鱼线进颈内动脉时，松开血管夹。从颈总动脉直线进入颈内动脉，操作难度也大大降低。改良后大鼠造模成功率明显提高，脑梗死面积稳定。TTC染色见图1。

3 讨论

缺血性脑血管病是神经科的常见病，多发病。［14］在脑血管病中，缺血性脑血管病占70%，而大脑中动脉梗阻型又占其中的百分之六十。所以，MCAO的研究在脑病的研究中占有重要地位。用大鼠复制脑缺血模型有成本低，种系内纯和性好，脑血管的解剖特点与人类相似等优点。［15］

缠于塑料圆圈模上的鱼线曲屈度符合颅内血管的走向，白色鱼线标记后入血管容易看见标记从而控制鱼线插入的长度。鱼线有一定的弹性质感，不像尼龙线线太过柔软而随意改变方向。鱼线遇水后变直而失去其原有的曲度。

多次实验表明，根据体重选择线栓直径至关重要。260-300g体重大鼠选择直径0.28mm的鱼线，240-260g体重的大鼠选择0. 265mm的鱼线。梗塞面积稳定，可复制性强。通过颈外动脉进入颈内动脉即从Y形分叉的两个分叉的一支进入另一支有很大的难度，实验操作可行性更差。而从颈总入颈内总体上呈直线进入，操作简单，可复制性强。1.8-2.0cm的进线深度和小于1.8cm大于2.2cm的进线深度比在提高成功率和减小损伤度方面是最合适的。小于1.8cm的进线深度往往未达到大脑中动脉而没有神经功能缺损症状，大于2. 2cm时大鼠梗塞症状重，死亡率大幅度提升。［16］

［1］包玉龙，朱竟赫，范英兰，等.线栓法与改良三氯化铁法致大鼠大脑中动脉闭塞模型的对比研究［J］.动物医学进展，2014，23（2）：26-27.

［4］田莹，余化霖.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型制作要点及进展［J］.齐齐哈尔医学报，2011，32（2）：256-258

［5］范瑞娟，罗亚非，孙玉凤，等.新式线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立［J］.中国民族民间医学，2014，23（2）：26-27.

［6］郭晓利，肖伟.线栓法大鼠大脑中动脉闭塞脑缺血动物模型的影响因素探析［J］.中医药临床杂志，2012，24（3）：239-241.

［7］杨飞雪，汪宁.浅谈缺血性脑血管病的病理生理机制［J］.黑龙江医药，2014，6（24）：1283-1285

［8］陈晓娟，肖宗宇.改良线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立［J］.中国医学创新，2015，12（3）：128-129

［9］何芳雁，韩春妮，李艳，等.制作线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的要点和体会［J］.实验动物科学，2013，30（4）：46-48.

［10］陈小睿，孟宪丽，孟宝华，等.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的评价与思考［J］.时珍国医国药，2009，20（2）：424-427.

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1674-2060（2016）02-0308-02

河南省高校人才项目（14204247）不同基础病变合并脑缺血大鼠模型对神经血管单元的影响

陈颜嫣（1988—），女，汉族，河南省唐河县人，河南中医学院2013级硕士研究生，致力于中西医结合防治脑血管疾病的相关研究。

张振强（1971—），男，汉族，河南省伊川人，河南中医学院科研处教授，致力于中西医结合防止脑病的基础和临床研究。