丁慧　俞咪娜　王亚会　于俊杰　尹小乐　薄惠文　黄星　刘永锋,*

(1南京农业大学 生命科学学院， 南京 210095；2江苏省农业科学院 植物保护研究所， 南京 210014；*通讯联系人, E-mail:liuyf@jaas.ac.cn)



稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

丁慧1,2俞咪娜2王亚会2于俊杰2尹小乐2薄惠文1,2黄星1刘永锋2,*

(1南京农业大学 生命科学学院， 南京 210095；2江苏省农业科学院 植物保护研究所， 南京 210014；*通讯联系人, E-mail:liuyf@jaas.ac.cn)

DING Hui, YU Mina, YU Junjie,et al. Molecular characterization ofUstilaginoideavirensT-DNA insertion mutant B2510. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 541-551.

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料，通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因，分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现，与野生型菌株P1相比，B2510田间接种表现为致病性减弱；在MM培养基上生长速率下降，而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异，但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入，利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列，经过比对分析发现，T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端，且稻曲菌基因组序列均未丢失，T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况，显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降，推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关，可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。

稻曲病菌； T-DNA插入突变； ATMT转化； 致病力； 侧翼序列

水稻稻曲病是一种穗部病害，随着气候的变化、施肥水平的增加等一些因素[1]，稻曲病发生频率上升，危害日益加重，已由次要病害上升为主要病害。稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)侵染稻粒可形成褐色至墨绿色的稻曲球，造成空秕率上升、千粒重下降，严重影响水稻品质和产量[2, 3]。而且稻曲球中还有稻曲菌素[4, 5]，能抑制微管蛋白组装，干扰细胞骨架形成，对人畜产生危害。因此，深入了解稻曲病的致病机理，可为抗病水稻的育种和新靶标药剂的开发提供理论依据。

目前，稻曲病菌的研究大都集中在其生物学特性[6]、侵染循环[7, 8]和病害防治[9, 10]及稻曲毒素[5, 11, 12]等方面，而对稻曲病菌的致病机理方面的了解比较缺乏。张震等[13]根据稻瘟病菌中PMK1的保守序列，克隆到了稻曲病菌的UVMK1基因，同时在稻瘟病菌中进行了功能验证；此外还通过构建稻曲病菌的cDNA文库，克隆到参与致病和防御过程中的R5基因[14]。刘联盟等[15]根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物，结合TAIL-PCR技术获得了其序列，为稻曲病菌致病机理的进一步研究奠定基础。利用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)是分离与鉴定病原菌的致病相关基因的一种有效途径[16]。通过ATMT方法将 T-DNA 随机插入到真菌的基因组中，构建突变体库，并根据突变体的表型筛选获得相关功能基因，已经在多个真菌中实现。Nakamura等[17]通过筛选刺盘孢菌(Colletotrichumsansevieriae)ATMT突变体库，研究了病原菌的致病相关基因；吴小燕等[18]通过筛选稻瘟病菌ATMT库，获得一株致病性增强的菌株，成功克隆并分析了相关基因MgThiJ1。稻曲病菌的ATMT方法也成功建立[19]。于俊杰等[20]研究分生孢子高产ATMT突变菌株 A2588，克隆到相关基因，并分析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能。俞咪娜等[21]通过筛选得到致病力增强菌株5062，克隆和分析了 T-DNA插入区域的相关基因，为稻曲病菌致病机理的解析、致病相关基因克隆奠定基础。王亚会等[22]对致病力丧失突变菌株B1464从生物学形态和分子遗传变异方面进行分析，发现T-DNA的插入导致了染色体重排，并破坏了C2H2锌指蛋白、苹果酸合成酶等基因的正常表达。

为深入认识稻曲病菌在水稻上的侵染和致病机制，我们通过研究农杆菌介导的T-DNA插入稻曲病菌致病力减弱突变体B2510的生物学特性，并利用TAIL-PCR技术克隆B2510基因组的T-DNA插入位点侧翼序列，RT-PCR检测突变基因表达量变化，分离并解析了可能与稻曲病菌致病相关的新的基因，在分子水平上为水稻抗稻曲病菌的育种和稻曲病的防治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1供试菌株与水稻

稻曲病菌的野生菌株P1，分离自田间自然发病的稻曲球上并取单胞菌株保存。致病力减弱突变菌株B2510(由本实验室通过农杆菌介导转化P1得到一个突变体库，并经过田间致病力测验筛选获得)，均由江苏省农业科学院植物保护研究所水稻病害与生物防治实验室保存。稻曲病菌ATMT突变体获得的具体方法参照Mullins等[23]的方法进行。常规DNA片段转化用的大肠杆菌E.colitrans T1购自北京全式金生物技术有限公司。

稻曲病菌致病性检测采用感病水稻品种两优培九。

1.2试剂

本研究的引物合成(表1)及测序由Invitrogen公司完成；限制性内切酶SalⅠ、HindⅢ和RNA提取用的Trizol、用于RT-PCR的RNA反转录酶(PrimeScript Reverse Transcriptase)均购自TaKaRa公司；PCR所用的TaqDNA聚合酶和连接所需的pEASY-T1 载体均购自北京全式金生物技术有限公司；Southern 杂交试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ)购自Roche公司，杂交用的带正电荷尼龙膜(Hybond N+)购自上海索莱宝生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自东盛生物科技有限公司。其他生化试剂购于美国的Sigma公司或国产分析纯。

1.3稻曲病菌突变体表型测定

取保存的原始菌株P1和突变菌株B2510，分别接种至PSA固体培养基(200 g/L马铃薯煮汁，20 g/L蔗糖，12 g/L琼脂)上活化，28℃培养15 d后，在菌落生长边缘处取菌碟(打孔器内径为3.5 mm)，用于生物学特性、致病力测定。以上各处理均设3次重复。

1.3.1菌株生长速率测定

取上述菌碟，分别接至PSA、TB3、MM固体培养基上，28℃避光培养20 d后观察菌落形态，测量菌落直径，每个处理重复3次。

1.3.2菌株分生孢子和菌丝形态观察

分别将P1和突变菌株B2510接种至含50 mL PS液体培养基的100 mL三角瓶中， 130 r/min摇培7 d，通过显微镜(10 × 40)观察分生孢子数量和测量菌丝直径，每次取10段不同菌丝。

表1引物列表

Table 1． Primers applied in the research.

引物名称Name引物序列Sequence(5’→3’)hyg1.4F[21]ACAGAAGATGATATTGAAGGAGChyg1.4R[21]TACTCTATTCCTTTGCCCTCGLAD8[21]ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNACGTG*LAD10[21]ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT*GFP-1[21]CCATCCTGGTCGAGCTGGAGFP-2[21]CGAACTCCAGCAGGACCATGGRB3[21]TGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCHLB1[21]GATTCCCAATACGAGGTCGCCAAHLB2[21]TGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGHLB3[21]AGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGAAC-S2[21]GAGTTTAGGTCCAGCGTCCGTCGACGATGGACTCCAGAGAC-S3[21]GAGTTTAGGTCCAGCGTCCGT8H1CGAGTTCCAACAGACCCCTA8R1ATGGCCAAACTTCAACCCTT10H1ATGGACCAGCCACAACTAAA10R1TGTCAAAGATGCAAGGTCART-1FGACCTTTTGTTCCGAGCCATRT-1RGTCTTTGGCGGGTTTATCAGRT-U-1ACCGCTTCAGCAGATGGGRT-U-2GGCGTCTGCTACTCGCTCTART-D-1GTCCCCTCAGGTCGCAATAGRT-D-2TAAGTTCCCTCCCACCAGCCα-tubulin2F[24]GGCGTTTACAATGGCACTTCα-tubulin2RCGGAACAGTTGACCAAAAGG

*B=T, C or G; N=A, T, C or G.

1.4菌株致病性测定方法

参考张君成等[24]的稻曲病菌接种方法，取1.3中所用野生菌株P1和突变菌株B2510的菌碟各2个，分别接种至PS培养液振荡培养，7 d后将含有孢子和菌丝的混合培养液接种水稻感病品种两优培九。每个菌株接10穗，每穗接种1 mL菌丝和孢子混合培养液。接种试验重复3次，分别接种于2014年8-9月江苏省农业科学院试验田内3个批次的水稻，21 d后调查水稻的发病情况。

1.5PCR检测和Southern杂交

接种菌丝块置于50 mL PS培养液中，28 ℃、180 r/min下振荡培养7 d后收集菌丝体，采用CTAB法提取菌株基因组DNA。以P1为对照，PCR检测突变体中的绿色荧光蛋白基因GFP(扩增引物为GFP-1和GFP-2)和潮霉素磷酸转移酶基因HPH(扩增引物为hyg1.4F和hyg1.4R)[21]。反应体系如下：2.5 μL 10×TransTaqHiFi PCR 缓冲液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，引物各1 μL，0.5 μL HiFi DNA 聚合酶(5 U/L)，1 μL基因组DNA，去离子水补齐25 μL。PCR条件：94℃下预变性4 min, 94℃下30 s, 60℃下60 s, 72℃下1.5 min (35个循环), 72℃下10 min。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

用引物hyg1.4F和hyg1.4R进行PCR，扩增pCAMBIA1300质粒中的HPH基因片段，回收产物。参照Southern杂交试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ)，将回收产物用DIG标记作为探针，使用终浓度为25 ng /mL。将约为5 μg B2510和P1的基因组DNA分别用SalⅠ、Hind Ⅲ单酶切过夜后，经过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，通过盐桥法将DNA转移到尼龙膜上，DNA通过紫外交联固定在尼龙膜上后，参照上述试剂盒提供的方法对附有DNA的尼龙膜进行预杂交、杂交，洗涤，显色。

1.6突变菌株侧翼序列的克隆及分析

利用TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced-PCR)法，采用简并引物LAD8和LAD10和特异性引物HLB1 / HLB2 / HLB3扩增插入的T-DNA片段的LB端邻接稻曲病菌序列，以稻曲病菌基因组DNA为模板扩增突变菌株T-DNA插入位点的侧翼序列。TAIL-PCR方法参照Mullins等[23]，具体引物序列见表1。

根据插入位点两端的侧翼序列分别设计引物8H1/8R1和10H/10R1。反应体系如下： 5 μL 10×TransTaqHiFi PCR 缓冲液，4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，引物各1 μL，0.5 μL HiFi DNA 聚合酶(5 U/L)，1 μL基因组DNA，去离子水补齐50 μL。PCR条件：94℃下预变性4 min，94℃下 30 s，60℃下 60 s，72℃下 4 min(35个循环)，72℃下10 min。使用的引物分别是8H1/8R1， GRB3/ 8R1和10H1/10R1，GRB3/10R1, PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收(参照说明书)，测序。

RT-PCR选用的RNA提取选用摇培4 d的菌丝体，采用Trizol法提取野生型菌株P1和突变菌株B2510的总RNA。RNA反转录方法参照试剂盒说明书。测序结果参照稻曲病菌的全基因组序列以及转录组序列，进行序列相似性比对和分析采用NCBI网站BLAST、ORF Finder等程序完成。

2　结果与分析

2.1突变菌株分子检测

为了确定T-DNA是否稳定地插入突变菌株中，将突变菌株在无潮霉素的PSA平板上经5轮传代培养后，再用CTAB法分别提取野生型菌株P1和突变菌株B2510基因组DNA，通过引物GFP-1/GFP-2和hyg1.4F/hyg1.4R分别对其进行PCR检测，扩增出约600 bp和约1 400 bp长的GFP基因和HPH基因片段(图1-A)，而在野生型菌株P1中没有扩增到条带。Southern杂交检测T-DNA在突变菌株B2510的拷贝数，结果表明T-DNA已经整合到稻曲病菌基因组中，且突变体中的T-DNA为双拷贝插入(图1-B)，这有利于后续T-DNA插入位点的分析和相关基因功能的研究。

2.2突变菌株B2510致病力减弱

田间分别接种突变菌株B2510和野生型菌株P1的菌丝和孢子混合液，21 d后调查发现，接种突变菌株B2510的水稻平均每穗有2个病粒，而接种菌株P1的水稻平均每穗有25个病粒，即突变菌株B2510的致病能力减弱(图2)。由此推测，外源T-DNA的插入可能影响到某个致病相关的正调控基因，从而减弱了菌株在水稻上的致病能力。

A-PCR检测，其中泳道1、3分别为以P1为模板检测GFP基因和HPH基因； 泳道2、4分别为以B2510为模板检测GFP基因和HPH基因。B-Southern杂交检测，其中泳道1为P1基因组SalⅠ、Hind Ⅲ双酶切后HPH基因Southern杂交；泳道2、3分别为B2510基因组SalⅠ、HindⅢ酶切后HPH基因Southern杂交。

A, PCR analysis of theGFPgene andHPHgene. Lanes 1 and 2, PCR detection of theGFPgenes of P1 and B2510, respectively. Lanes 3 and 4, PCR detection of theHPHof P1 and B2510. Lane M, DNA marker; B， Southern blot detection of B2510, showing that a double T-DNA insertion event occurred in the B2510 genome. Lane 1, Genomic DNA of P1 was digested withSalⅠ andHind Ⅲ. Lanes 2 and 3, Genomic DNA of B2510 was digested withSalⅠ,HindⅢ, respectively.

图1稻曲病菌突变菌株B2510的分子检测

Fig. 1. Molecular detection of mutant strain B2510.

A-突变菌株B2510接菌稻穗上的稻曲球数显著少于野生菌株P1。粗箭头所指为稻曲球； B-突变菌株B2510和野生菌株P1分别接种两优培九后病粒数统计。**表示极显著性差异，P< 0.05。

A,Number of diseased grains caused by the mutant strain B2510 was significantly decreased than that of wild strain P1. The coarse black arrows indicate false smut balls; B, Statistical analysis of the number of diseased grains per panicle on Liangyoupeijiu.**shows significant difference at 0.05 level.

图2突变菌株B2510的致病性测定

Fig. 2. Pathogenicity test of the mutant strain B2510.

2.3突变菌株表型分析

将突变菌株B2510与野生菌株P1分别接种在PSA、TB3、MM培养基上培养20 d后测量菌落直径。突变菌株B2510在营养较丰富的PSA和TB3培养基上，与野生型菌株P1相比，生长速率和菌落色泽没有显著差异，但其菌落形态上明显不同，菌丝生长得更致密且生成褶皱。在MM培养基上，突变菌株B2510的菌落形态与野生型菌株P1相比，菌丝没有径直往外延伸，从而显得更稠密。B2510的生长速度较慢，菌落直径为18.81 mm，野生菌株P1对应的菌落直径为25.92 mm(图3-A、B)，两菌株在生长速率上差异极显著。

将B2510和P1分别进行液体PS培养液摇培，6 d后，取菌液用血球计数板计算产分生孢子量，并观察孢子形态。结果显示，突变菌株B2510不产生分生孢子，只产生菌丝(图3-C)。通过显微镜测量比较后发现(图3-D)，B2510的菌丝比P1小，且差异极显著。由此推测，T-DNA的插入可能破坏了B2510基因组营养吸收、运输或利用相关基因，使其不能正常地使用环境中的营养物质，导致生长速率下降，产孢能力降低，菌丝生长异常，从而使其致病能力减弱。

2.4突变菌株T-DNA插入位点侧翼序列克隆与分析

TAIL-PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼序列的一种有效方法。首先，分别以P1和B2510的基因组DNA为模板，使用T-DNA特异性引物HLB1/HLB2/HLB3和简并引物LAD8和LAD10扩增T-DNA的LB端侧翼序列，得到长度分别为959 bp和1055 bp的两段特异序列。将得到的两段序列与农杆菌双元载体和稻曲病菌基因组序列进行比对(图4-A)，发现突变菌株中两个T-DNA的LB端都只有末端4～6个碱基发生变化，获得稻曲病菌基因组上序列长度分别为55 bp和210 bp。

将上述获得的两段 T-DNA 侧翼序列与稻曲病菌全基因组序列进行比对。根据得到的序列设计引物8R1和10R1，分别与引物GRB3扩增P1和B2510基因组，得到插入位点的RB端序列分别为500 bp和300 bp左右(图4-B、C)，比对发现T-DNA和稻曲基因组都没有发生碱基丢失。

A-突变菌株B2510与野生菌株P1在MM、PSA 和TB3这三种不同培养基上菌落直径的比较。在MM培养基中突变菌株B2510的生长速率明显慢于P1，且差异极显著；B-突变菌株B2510与P1分别在MM、PSA 和TB3不同培养基上的菌落形态, 图中标尺=1 cm; C-在显微镜(10× 40)下观察到的突变菌株B2510与P1孢子和菌丝，标尺= 20 μm；D-突变菌株B2510与P1菌丝直径的比较。

A, Difference of colony diameters between mutant strain B2510 and wild-type strain P1 on MM, PSA and TB3 medium. The growth rate of B2510 was significantly slower than that of P1; B, Colonies of mutant strain B2510 and P1 on different media; bar=1 cm; C, Analysis and comparison of conidium and hypha between mutant strain B2510 and P1 under microscope (10× 40); bar= 20 μm; D, Comparison of the sizes of hypha between mutant strain B2510 and P1.

图3突变菌株B2510和野生菌株P1的菌丝生长及产孢特性分析

Fig. 3. Analysis of colonies and sporulation of mutant strain B2510 and wild-type strain P1.

根据上述得到的序列，设计引物8H1、10H1，分别和8R1、10 R1以P1和B2510基因组为模板进行PCR扩增。结果在B2510基因组中能扩到约4 kb的条带，经测序验证为目的片段；而在P1基因组中分别扩增到1500 bp和1000 bp左右的片段(图4-B、C)，经测序验证为稻曲病菌的序列。

2.5突变菌株T-DNA插入位点侧翼基因分析

将T-DNA插入的两个侧翼序列分别与稻曲病菌全基因组序列比对，得到两个基因即UV8b_1412和UV8b_1386。BioEdit分析T-DNA插入位点，发现在UV8b_1412基因中T-DNA插入到5′上游区域，距起始密码子1069 bp(图5-A、B)，Promoter 2.0 Prediction预测显示T-DNA插入位点很有可能是启动子区域。在UV8b_1386基因中T-DNA插入在距终止密码子400 bp左右处。提取 PS 培养液中摇培 5 d 的稻曲病菌菌丝的RNA， 使用RT-1F/RT-1R和α-tubulin2F /α-tubulin2R引物对基因组表达量进行半定量 RT-PCR 检测，结果表明UV8b_1412基因表达水平明显降低(图 5-C)，推测该基因表达水平降低可能是导致产孢能力丧失、致病力减弱的原因之一。以同样的方法设计引物RT-U-1/RT-U-2和RT-D-1/RT-D-2检测UV8b_1386基因的表达水平，发现插入位点基因5′端能正常表达，而3′端不表达(图5-D)，推测该基因在突变体中不能形成完整的蛋白。

进一步分析两个基因UV8b_1412和UV8b_1386，发现UV8b_1412编码区全长3646 bp，含有两个分别为1278 bp和91 bp内含子，基因编码一个含758个氨基酸的C6 转录因子(GenBank: KDB17528.1)蛋白。将该蛋白与一些植物病原真菌中同源蛋白进行氨基酸同源序列比对和系统发育树分析，发现稻曲病菌中的C6转录因子与其他真菌的同源性都很低，最高的是白僵菌(Beauveriabassiana)，为43%，可以看出UV8b_1412编码的C6 转录因子在稻曲病菌中有一定的独特性(图6-A)。

A-突变体B2510中T-DNA插入的结构以及各引物在基因组上的位置； B,C-PCR验证T-DNA插入位点处右端的侧翼序列，并分析T-DNA插入后的基因组序列变化。

A, Schematic diagram of T-DNA insertion event in mutant B2510 and the positions of primers on genome; B and C，Analysis of T-DNA right border flanking region and genome sequence after T-DNA insertion using PCR.

图4突变菌株B2510 T-DNA 插入位点侧翼序列的扩增与分析

Fig. 4. Cloning and analysis of T-DNA flanking region in mutant strain B2510.

UV8b_1386编码区全长2691 bp，含有4个分别为128 bp、88 bp、66 bp和78 bp的内含子，CDS序列编码一个含776个氨基酸的类RasGTP酶激活蛋白(GenBank: KDB17502.1)。通过与一些真菌同源蛋白的氨基酸序列比对和系统发育树分析发现(图6-B)，其RasGTP酶激活蛋白与绿僵菌的同源性最高(96%)，亲缘关系最近；且与其他真菌的同源性也很高，与里氏木霉(Trichodermareesei)、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的同源性分别为92%、90%和92%；与稻瘟病菌同源性最低，也达到88%，说明该蛋白在真菌生物中非常保守。

3　讨论

T-DNA插入突变已经成为标记和分析功能基因的一种有效途径，并广泛应用于植物、丝状真菌等生物。本研究的菌株B2510就是通过该方法转化野生型菌株P1筛选获得的。通过生物学特性及T-DNA插入位点侧翼基因的分析，发现其在营养缺乏的条件下生长速率下降，说明T-DNA插入在一定程度上影响了营养的运输，这可能与致病力的减弱有关。

目前，对于稻曲病菌的传播与侵染过程方面比较认可的观点是，稻曲病菌以菌核、厚垣孢子等形式在田间或稻种上越冬，次年在适宜条件下萌发，在芽期、苗期或孕穗期侵染水稻，或是随风飞散的各种形式的孢子落在孕穗期叶鞘内或直接侵染花器致病[2, 24]。张君成等[24]认为采用稻曲病菌分生孢子和菌丝混合液对水稻接种，可以得到较高的发病率，且在一定范围内孢子浓度越高越容易发病；李燕等[25]也证明了稻曲病菌的产孢量与致病力正相关，表明稻曲病菌的分生孢子在其侵染过程中起着重要作用。本研究中的B2510突变体丧失产孢能力，其致病力减弱，验证了上述研究结果，同时也从另一方面说明单独的稻曲病菌菌丝也可以侵染水稻并形成稻曲球。

A,B-两个基因中 T-DNA插入位置； C,D-RT-PCR检测突变菌株B2510中两个基因的表达变化，α-tubulin为内参基因。D中Uv8b_1386-Up指的是该基因5′端的表达量，Uv8b_1386-Down则是基因3′端的表达量。

A and B, Schematic diagram of T-DNA insertion event in the two genes; C and D, RT-PCR analysis of the expression level of the two genes in mutant strain B2510,α-tubulinwas used as the reference gene. In Fig.5-D,Uv8b_1386-Up indicates the expression of 5′ flanking region ofUv8b_1386, andUv8b_1386-Down, the expression of the gene 3′ flanking region.

图5稻曲病菌突变菌株B2510中T-DNA 插入位点侧翼基因分析

Fig. 5. Analysis of T-DNA flanking gene in U.virens mutant strain B2510.

C6 转录因子是一种类似GAL4调控的Zn2Cys6锌指蛋白类转录因子。Zn2Cys6基序中的半胱氨酸与2个锌离子结合,因而命名为Zn2Cys6锌指蛋白,这类蛋白仅存在于真菌中,可参与调节真菌的基础代谢、次级代谢、药物抗性及减数分裂等过程,对其生长发育起到一定的影响[26]。C6 转录因子属于真菌转录因子MHR超级家族,调控中间包含一个N端C6双核簇结构的同源区域[27, 28]。在稻瘟病菌上敲除该类转录因子，有部分突变体表现为生长速率减慢，产孢量减少，孢子萌发率及附着胞形成率降低，致病力减弱，说明Zn2Cys6锌指蛋白类转录因子在一定程度上影响着稻瘟病菌的生长发育及致病性[29]。链孢霉中也发现一类GAL4类型的C6 锌指簇蛋白，是 在分生孢子的萌发和生长调节过程中一种必需的转录因子[30]。Ras-GTP酶激活区域被称为RasGAP[31, 32]，它绑定在Ras-GTP酶上，促进GTP水解为GDP[33]。RasGTP酶在一些信号通路中作为分子开关，且当GAP活性降低时，信号传递会延迟[34]。在曲霉属和镰刀菌属中孢子形成和毒素产生都是在G蛋白信号通路上被调控的[35, 36]，RasGAP是G蛋白信号通路上的一个重要组成部分，因此也间接对真菌的生长起到一定的调控作用。 突变体B2510不能产生分生孢子，且菌丝直径比P1小，可能是由于GAPA蛋白被破坏，使细胞中的某种物质不能特异性结合在GAPA区域，导致传递信号的通路受阻，影响细胞骨架的形成和物质的运输，从而对细胞的生长起到一定的抑制作用。

A-通过MEGA6程序计算其分散距离，制作稻曲病菌的C6 转录因子与其他16种不同真菌同源蛋白的系统发育树；每个菌株后的号码与GenBank中登记的一致。B-通过MEGA6程序计算其分散距离，制作稻曲病菌的类RasGTP酶激活蛋白与其他10种不同真菌同源蛋白的系统发育树；每个菌株后的号码与GenBank中登记的一致。

A, Phylogenetic tree of C6 transcription factor ofU.virensand 16 other species was constructed by observed divergency distance method in the program MEGA6. Numbers correspond to GenBank accession numbers. B, Phylogenetic tree of GTPase-activator protein for Ras-like GTPase containing protein ofU.virensand 10 other species was constructed by observed divergency distance method in the program MEGA6. Numbers correspond to GenBank accession numbers.

图6基于蛋白氨基酸序列的稻曲病菌及其他多种真菌的系统发育分析

Fig. 6. Phylogenetic tree of U.virens and several fungi based on amino acid sequence of proteins.

本研究从稻曲病菌T-DNA插入突变体库中筛选得到一株致病力减弱突变体B2510。对突变体B2510的生物学和分子生物学研究发现其与野生型相比表现为：丧失产孢能力，菌丝直径变小；T-DNA双拷贝插入基因组，且分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3’端；两个基因在突变体中的表达量均下降。由于T-DNA插入破坏了两个基因，可能是单个基因或是两个基因共同作用使突变体B2510的表型发生变化，要明确各个基因的功能，还有待后续通过基因敲除等方法进行进一步研究。

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Molecular Characterization of Ustilaginoidea virens T-DNA Insertion Mutant B2510

DING Hui1,2, YU Mi-na2, WANG Ya-hui2, YU Jun-jie2, YIN Xiao-le2, BO Hui-wen1,2, HUANG Xing1, LIU Yong-feng2,*

(1College of Life Science， Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: liuyf@jaas.ac.cn)

To isolate the gene concerned with molecular pathogenic process ofUstilaginoideavirens(U.virens) , T-DNA integration flanking sequence and the mutant genes of a mutant strain B2510 were analyzed. Compared with the wild-typeU.virensstrain P1, the pathogenicity of the mutant strain B2510 in the field was significantly decreased. The growth rate of B2510 on MM medium was slower than that of P1, but was not significantly different on PSA and TB3medium which were nutritionally endowed. The mutant strain B2510 did not produce conidiophores in PS broth medium. Genomic Southern bolt analysis confirmed that there were double T-DNA events inserted in genome of mutant strain B2510. The flankingU.virenssequences of T-DNA obtained by TAIL-PCR were adjacent in the wild type and with no sequences lost, and only a few bases of T-DNA were changed. The T-DNA insertion site was in the promoter region ofUV8b_1412 and downstream 3′region ofUV8b_1386, respectively. RT-PCR analysis confirmed that the expression of both of two genes in B2510 were significantly decreased. The genes which were affected by T-DNA insertion may be associated with pathogenicity and participate in the regulation of pathogenic process ofU.virensin rice.

Ustilaginoideavirens; T-DNA insertion mutant; ATMT transformation; pathogenicity; flanking sequence

2015-12-31； 修改稿收到日期: 2016-03-25。

江苏省农业科技自主创新基金资助项目[CX(15)1054]； 国家自然科学基金资助项目(31301624)。

Q343.5; S435.111.4+6

A

1001-7216(2016)05-0541-11

丁慧, 俞咪娜, 王亚会, 等. 稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析. 中国水稻科学， 2016， 30(5)： 541-551.