周亚辉

摘要 褐变问题在植物组织培养过程中普遍存在，严重影响了外植体的生长与分化，结合国内外研究褐变的相关报道，综述了植物组织培养中褐变的影响因素和防止措施。

关键词 植物组织培养；褐变；影响因素；防止措施

中图分类号 Q813.1+2 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2016）05-0117-02

近年来，随着科学技术的迅猛发展，植物组织培养已成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，其被广泛应用于科研和生产，在农学、花卉、林业、医药业等领域中取得了巨大的经济、社会效益。但是，植物组织培养过程中褐变问题普遍存在，褐变的发生会严重影响外植体的生长与分化，甚至导致培养材料的死亡，褐变问题已成为组织培养中的一大难题。褐变的影响因素是复杂的，随外植体种类、基因型、取材部位及生理状况等的不同而危害程度有所区别，国内外也研究报道了一些减少或防止褐变的方法。本文系统归纳了植物组织培养褐变的影响因素和防止措施，对深入研究褐变问题和组织培养技术都有着非常重要的意义。

1 褐变的影响因素

1.1 外植体基因型

在植物组织培养中，有些品系容易褐变，诱导困难，而有些品系褐变较少，愈伤组织化容易些，组培容易成功，其原因之一可能是酚类物质含量及多酚氧化酶活性上的差异。

1.2 外植体的生理状态

外植体本身的生理状态不同，接种后褐变的程度也不同。致褐物质的含量会因生理年龄、季节、取材时间及部位的不同而不同。

1.3 培养基成分和培养条件

无机盐浓度、培养基pH值、培养基状态及植物激素等不适宜，均会引起褐变的产生。此外，培养过程中温度过高或光照过强，也会加速褐变的产生。

1.4 培养时间

接种后转瓶时间的早晚也是影响褐变的因素，接种后外植体培养时间过长，未及时转瓶，会使培养材料伤口积累过多酚类物质，导致褐变。

2 褐变的防止措施

2.1 外植体的选择

2.1.1 基因型。在相同培养条件下，甜菜二倍体品系外植体发生褐变的频率低于四倍体品系。Dalal等[1]比较2个葡萄品种“Pusa Seedless”和“Beauty Seedless”的褐变时，发现后者比前者严重，酚类化合物含量也是后者明显高。因此，在组织培养中应注意不同基因型的筛选，选择褐变程度较小的材料来进行培养。

2.1.2 生理年龄。外植体年龄对褐变有较大影响，Chevre分析表明欧洲栗幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。周 艳等[2]研究发现马缨杜鹃的二年生茎段在组织培养过程中的褐变率最低。

2.1.3 取材时期。致褐物质的含量会因季节的不同而不同，冬季褐变少，夏秋季褐变最严重，存活率最低。对柿树离体繁殖中外植体的褐变研究结果表明，2月取即将萌动的休眠芽进行培养，褐变死亡率低，4月取嫩枝茎尖进行培养，褐变死亡率高[3]。紫叶黄栌在1月取休眠枝条组织培养后外植体褐变程度最轻。

2.1.4 取材部位。平阴玫瑰不同品种、同一品种不同芽位的外植体在组培中褐变发生情况不同，但5个品种各芽位的平均褐变度均呈单峰型变化，且峰值均在第4芽。张素勤等[4]研究报道，非洲菊幼嫩叶片、花蕾、花托和花梗不同外植体中叶片的褐变程度最重，花蕾的褐变程度最轻。

2.2 外植体的预处理

在非洲菊叶片组织培养接种前将外植体用100 mg/L VC溶液浸泡1 h，使褐变现象得到有效控制[4]。青钱柳外植体先于4 ℃低温预处理5 d和直接用烧红的手术刀快速切割外植体后再进行接种可有效减少外植体的褐变。紫叶黄栌嫩茎组织培养前经0.1% HgCl2灭菌2～3 min，外植体褐变程度最轻。

2.3 适当的培养基状态和成分

2.3.1 培养基状态。液体培养基可有效克服外植体褐变，因为在液体培养基中，外植体溢出的有害物质可以很快扩散，对外植体伤害较轻。潘 梅等[5]在淮山组织培养抑制褐变的研究中发现液体培养淮山组织褐变程度较固体培养轻。尚旭岚等[6]研究报道，鹤望兰纸桥液体培养可以有效降低外植体的褐变度。

2.3.2 培养基成分。选择适宜的无机盐成分、蔗糖浓度和激素水平也是十分重要的。牛尾菜组织在不同激素配比的培养基中，随着6-BA和NAA浓度的提高，外植体发生褐化时间呈现提前的趋势。此外，相对于基本培养基MS、1/2MS，在低无机盐离子浓度WPM基本培养基中，可减缓外植体褐化程度。银杏组织培养在蔗糖浓度为5%的培养基上，愈伤组织增长倍数最高。

2.3.3 添加抗氧化剂和吸附剂。在植物组培中常用于抑制褐变的抗氧化剂有抗坏血酸、硫代硫酸钠、多胺等，常用的吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等。郑晓丹等[7]发现海南龙血树组织培养抗褐变的最适处理是培养基里加入维生素C然后泡半胱氨酸。魔芋组织培养中在培养基中分别添加活性炭、半胱氨酸、二氧化硫、聚乙烯吡咯烷酮或抗坏血酸等都能有效降低魔芋组织培养中的褐变率[8]。

2.4 合适的培养条件

温度过高或光照过强，可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐变，尤其是初期暗培养及保持较低温度（15～20 ℃）有降低褐变的作用[9]。卡特兰在10～20 ℃时褐变程度要比20 ℃以上时轻。魔芋组织培养中温度25～30 ℃、光照1 500 lx的条件下培养物褐变率仅为6%，愈伤组织诱导率达94%，成功率最高。

2.5 缩短转瓶时间

及时转接培养物可减轻醌类物质对培养物的毒害作用，显著减少材料的褐变。在山月桂树的茎尖培养中，接种后12～24 h便转入液体培养基中，然后每天转移1次，连续1个星期，褐变便得到完全控制[9]。软枣猕猴桃组织培养过程中每隔10～15 d转换1次培养基可有效控制褐变并保持植株正常生长。

3 参考文献

[1] DALAL MA，SHANNA BB，RAO MS.Studies on stock plant treatment and initiation culture mode in control of oxidative browning cultures of grapevine[J].Sci Hort，1992（51）：35-41.

[2] 周艷，陈训.马缨杜鹃组织培养过程中外植体褐变与多酚氧化酶及酚类物质的关系[J].种子，2009，28（7）：61-63.

[3] 张妙霞，孔祥生，郭秀璞，等.柿树组织培养防止外植体褐变的研究[J].河南农业大学学报，1999，33（1）：89-93.

[4] 张素勤，邹志荣，耿广东，等.非洲菊组织培养抑制褐变现象的研究[J].贵州农业科学，2007，35（2）：56-57.

[5] 潘梅，王景飞，黄赛，等.淮山组织培养抑制褐变的研究[J].江苏农业科学，2014，42（6）：57-59.

[6] 尚旭岚，张健，夏晗.鹤望兰组织培养的褐变因素及防止措施[J].四川农业大学学报，2003，21（3）：61-64.

[7] 郑晓丹，胡燕梅.海南龙血树组织培养及抗褐变的研究[J].武汉生物工程学院学报，2011，7（4）：235-237.

[8] 李剑美，寸湘琴，谢世清.魔芋组织培养中的褐变机理及防控措施[J].中国农学通报，2006，22（5）：234-236.

[9] 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].兰州：甘肃科学技术出版社，2003：48-49.