张雪娜，贾海滨，李　橙，王　伟，张丽秀，冯圣东*，杨志新，2*

（1.河北农业大学资源与环境科学学院，河北 保定 071000；2.河北省农田生态环境重点实验室，河北 保定 071000；3.河北省环境科学研究院，石家庄 050000）

添加淀粉和通气对固定化Fusarium.sp修复煤矿区老化污染土壤HMW-PAHs的影响

张雪娜1，贾海滨1，李橙3，王伟1，张丽秀1，冯圣东1*，杨志新1，2*

（1.河北农业大学资源与环境科学学院，河北 保定 071000；2.河北省农田生态环境重点实验室，河北 保定 071000；3.河北省环境科学研究院，石家庄 050000）

为了提高Fusarium.sp对PAHs的修复效果，在典型煤矿区老化污染土壤中添加淀粉和通气，经为期60 d的土壤培养试验，研究玉米秸秆固定化Fusarium.sp对土壤10种HMW-PAHs的修复效果及不同处理下土壤中酶活性变化规律。结果表明：HMWPAHs（High molecular weight-PAHs）总量去除率表现为固定化菌剂+淀粉+通气处理（J+D+O，29.19%）≈固定化菌剂+淀粉处理（J+D，25.89%）＞固定化菌剂处理（J，16.54%）；4环、5环和6环PAHs去除率在J+D+O和J+D两组处理间的差异均不显著，且与J处理相比均有显著提高（P＜0.05）；三组处理对单个HMW-PAH的去除率分别为9.12%～21.73%、17.93%～43.12%、24.34%～35.79%，J+D+O 和J+D处理对单个HMW-PAH的修复效果均有显著促进作用，其中，对BkF的去除增幅最大，分别增加了68.09%、63.78%。从酶活性规律看，土壤过氧化氢酶活性呈CK＞J＞J+D＞J+D+O（P＜0.05）的规律，且与10种PAHs单体的去除率呈显著或极显著负相关；土壤木质素过氧化物酶活性却与Chry、BkF、InP、DbA、BghiP去除率呈显著正相关。综上认为，不同处理对单个PAHs的去除具有其选择性，且添加淀粉的两处理均显著提高了土壤中HMW-PAHs的修复效果。

典型煤矿区；HMW-PAHs；固定化Fusarium.sp；淀粉；通气；土壤酶活性

张雪娜，贾海滨，李橙，等.添加淀粉和通气对固定化Fusarium.sp修复煤矿区老化污染土壤HMW-PAHs的影响［J］.农业环境科学学报，2016，35 （9）：1709-1716.

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多环芳烃（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是由两个或两个以上苯环组成的一类化合物，具有致癌、致畸、致突变的性质［1-2］，是美国环境保护署优先控制的持久性有机污染物［3］，其中4环及4环以上的高环PAHs（High molecular weight-PAHs，HMW-PAHs），因疏水性、亲脂性、稳定性更强，不易被去除［4-5］，最终会通过食物链和其他暴露途径对人体产生威胁［6］。环境中绝大多数的PAHs积累于土壤中［7］，煤矿区、焦化厂区及其影响的农田土壤范围是典型的多环芳烃污染场地［8］，如本课题组前期对河北省某煤矿区农田土壤中PAHs进行生态风险评估发现，89%土壤存在生态风险［9］，10种HMW-PAHs总含量为3 392.77 μg·kg-1，而一般污染农田土壤中以低环PAHs积累为主［10］。目前许多研究主要集中于土壤中PAHs的含量分布、来源、迁移转化特征以及PAHs的物化性质与其环境行为间的关系、风险评价等方面，对煤矿区附近土壤中PAHs污染修复的研宄较少［11］，煤矿区农田污染土壤的修复迫在眉睫。

目前，环境友好的微生物修复是土壤中PAHs修复的主要途径之一。在真菌修复中，关于白腐真菌的研究报道较为深入［12-13］，而镰刀属真菌（Fusarium.sp）修复PAHs老化污染土壤仅见零星报道［14］。本课题组前期在煤矿区污染土壤中筛选出的Fusarium.sp培养7 d对无机盐溶液 BaP、BKF、DbA、BghiP、InP单个PAH的去除率均达38%以上，证实了它是具有去除HMW-PAHs潜力的菌株。微生物固定化技术是一种有效的土壤修复技术，能够显著增强微生物的环境适应能力和污染物去除能力，极大地提高污染土壤修复效果［15-17］，Su等［16］证实固定化的真菌对环境具有更强适应能力和更快的反应启动速度。此外，许多学者已证实，通过外加碳源如水杨酸、邻苯二甲酸、邻苯二酚、矿物油、葡萄糖等可提高微生物对PAHs的去除效果［18-22］，而大分子淀粉的作用影响研究尚少［23］。课题组前期发现，添加淀粉可显著促进Fusarium.sp对无机盐溶液中HMW-PAHs的去除，1 g·L-1淀粉使Fusarium.sp对其去除率达到了83.07%，该菌株在淀粉外加碳源的条件下效果卓越。

本研究针对通过淀粉强化固定化Fusarium.sp修复煤矿区老化HMW-PAHs污染土壤是否也能达到较为理想的效果，以及其降解效果与前人研究的对PAHs去除相关的土壤酶活性是否有关等问题［24-26］，以河北某典型煤矿区长期污染的农田土壤为研究对象，利用玉米秸秆载体材料将Fusarium.sp ZH-H2固定化，在添加淀粉并伴随通气措施下，研究该菌剂对污染土壤HMW-PAHs的修复效果以及土壤酶活性变化规律，以期为煤矿区农田土壤HMW-PAHs的修复提供理论依据及技术支撑。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验用土取自河北某典型煤矿区周边农田，阴干后过2 mm筛，4℃冰箱内保藏待用。其基本性质见表1，10种HMW-PAHs总含量为3 392.77 μg·kg-1，各PAHs含量比例如图1所示。

供试菌株ZH-H2（Fusarium.sp）为本课题组前期在煤矿区农田土壤中筛选的HMW-PAHs高效去除菌。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏号：CGMCC No.9316，已申请专利（专利号：201410432336.5）。

表1　土壤基本理化性质Table 1 The basic physical and chemical properties of soil

图1　土壤中单个PAH在∑10种PAHs的百分含量Figure 1 The proportion of individual PAHs content in total

供试载体玉米秸秆，取自河北省保定市，将其洗净，杀青30 min（105℃），阴干粉碎，过1 mm筛，并分别与草炭土按1∶2混合均匀，121℃灭菌20 min，备用。

有机试剂丙酮、二氯甲烷、氘代三联苯（替代物），4溴-2氟联苯（替代物）、氘代苝（内标物质）等均购于北京百灵威试剂公司。

1.2样品制备

菌种培养：从斜面挑取一株ZH-H2菌接入高氏一号固体培养基的培养皿中，培养皿用封口膜封口，在30℃恒温培养箱中培养7 d。用无菌水反复冲洗吹打菌落，菌液经灭菌的4层纱布过滤后，得到孢子悬浮液，再用灭菌水调节孢子的数量为1.25×107cfu·mL-1，作为原液备用。取出5 mL原液放入20 mL高氏一号液体培养基中，摇床培养2 d得到菌丝悬液。

载体菌剂制备：分别称取1.1中制备的秸秆材料90 g放入500 mL锥形瓶（共9瓶）。于121℃高温高压灭菌20 min，降温后分别加入上述菌液，并适当补充无菌水，在30℃、150 r·min-1摇床条件下培养3 h，即得到固定化ZH-H2的玉米载体材料，用于土壤培养试验。

1.3试验方案

采用上口直径13 cm，底面直径9 cm，高11 cm的试验用塑料盆钵，土壤培养试验处理见表2。试验设置3个处理，每个处理3个重复，共12个盆钵。取210 g阴干土放入每个盆钵中，依据表2处理方案按3∶7质量比向土壤中添加灭菌载体材料和玉米秸秆固定化ZH-H2载体材料，淀粉添加量为5 g·kg-1，充分混合后调节水分含量为田间持水量的60%，将盆钵置于30℃恒温培养箱中培养。每2 d补水一次，通气时间设定在灌水以后，由空气压缩机注入，输气管平铺于土壤中，由土壤的体积质量、孔隙度和体积含水率计算注入空气量，通气量系数为0.05，以2 d为一个通气周期，60 d后采集土壤样品。将每盆土壤混合均匀后采用四分法分取样品，一半土壤样品过1 mm筛，密封，置于4℃冰箱中保存，用于测定PAHs的残留量；另一半自然阴干后过1 mm筛，用于测定土壤酶活性。

表2　土壤HMW-PAHs去除的试验方案Table 2 The treatments of HMW-PAHs degradation in soil

1.4样品的测定指标及方法

土壤基本理化性质采用土壤农化常规分析法［27］。

HMW-PAHs指标测定及分析方法：Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP，总计 10 种HMW-PAHs。采用超声-索式联合提取法提取，称取土壤样品20 g及10 g无水硫酸钠，混合均匀后，加入替代物（20 μg·mL-1氘代三联苯与4-溴-2氟联苯）20 μL，用丙酮与正己烷体积比1∶1的提取剂超声提取30 min，索氏水浴温度70℃提取12 h，经过干燥、浓缩、净化、再次浓缩定容，通过气相色谱-质谱法（GC-MS，Aglient 7890/5975c）测定样品［28］。GC-MS程序升温步骤：起始温度为80℃，保持2 min；以10℃· min-1上升到140℃，保持3 min；再以10℃·min-1上升到210℃保持3 min；最后以5℃·min-1上升到290℃保持3 min。进样口温度为280℃，进样量为1 μL，不分流进样，流速为1.1 mL·min-1，离子源温度230℃，四极杆温度150℃［28］。

土壤酶活性测定指标及分析方法：土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，以20 min每克土壤消耗0.1 mol·L-1KMnO4的毫升数表示：土壤木质素过氧化物酶活性以每分钟使1 μmol黎芦醇氧化成黎芦醛所需的酶量为一个酶活力单位（U）表示，黎芦醛的摩尔吸光系数ε=9300 L·mol-1·cm-1［29］。

气相色谱仪-质谱仪联用，气相色谱仪为安捷伦7890，质谱仪为美国HP5975系列。

回收率和检测限的测定参考EPA标准方法。回收率采用土壤基质加标法，氘代三联苯与4-溴-2氟联苯回收率控制在70%～130%，同时设置样品的20%进行平行提取试验［28，30］。

1.5数据统计分析

HMW-PAHs的去除率（Rs）=（C0-Ct）/C0×100%式中：C0为对照土壤HMW-PAHs的含量；Ct为土壤中HMW-PAHs的残留含量（相对去除率）。

本论文数据采用Excel 2003和SPSS 17.0软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1淀粉和通气促进固定化ZH-H2菌剂修复土壤HMW-PAHs的研究

2.1.1ZH-H2菌剂修复土壤HMW-PAHs总量

在不同处理条件下，固定化ZH-H2菌剂对土壤10种HMW-PAHs总量及不同环数成分的去除效果见图2。HMW-PAHs总量去除率在J+D和J+D+O处理间差异不显著（P＞0.05），分别为25.89%和29.19%，但均显著高于处理J（16.54%），分别提高了56.5%、76.0%，说明添加淀粉能够显著促进固定化ZH-H2菌剂对土壤中10种HMW-PAHs总量的去除，而增加空气对其去除影响并不显著。

比较不同环数的去除率可知（图2），在J+D和J+ D+O两组处理下，6环PAHs总量的去除率均高于4环和5环，分别为38.31%和35.73%，J处理下不同环数之间的去除效果差异不显著。另外，各环在J+D+O 和J+D两组处理间的差异均不显著，且与J处理相比均有显著提高（P＜0.05），J+D+O与J相比，4环、5环和6环PAHs去除率分别提高了61%、100%和80%，去除效果提高显著；J+D与 J相比分别提高了39.34%、54.89%和92.81%，去除效果提高显著。可见，添加淀粉并伴随通气条件对5环PAHs总量的去除提高最突出，而只添加淀粉处理对6环PAHs总量的

图2　不同措施下固定化ZH-H2菌剂对土壤总量及不同环数PAHs的去除效果Figure 2 The degradation of the total PAHs and the PAHs with different rings in soil by immobilized ZH-H2 in the different treatments

去除提高更明显。

2.1.2ZH-H2菌剂修复土壤单个HMW-PAH

如图3所示，在J处理下，单个PAH去除率范围为9.12%～21.73%。经检验，BaA的去除效果最佳，去除率达21.73%；其次为Flt、Pry、Chry、DbA、InP和BghiP；BkF和BaP的去除效果最差，去除率为9.12%、11.66%。但与课题组前期向老化污染土壤中添加0.1 g·kg-1游离菌相比，ZH-H2对 BbF、BKF、BaP、InP、DbA、BghiP的去除率（5.49%、8.46%、0.35%、6.75%、5.79%、7.06%）分别提高了1.94、0.08、32.32、1.29、2.60、1.66倍，对PAHs的去除效果显著。这说明在该矿区长期污染的老化土壤中添加该固定化菌剂对10种单个HMW-PAHs均有不同程度的去除潜力且比游离菌对老化污染土壤的修复效果高。在J+D处理下，10种HMW-PAHs去除率范围为17.93%～43.12%。经检验，在10种PAHs中，各PAH的去除效果由大到小依次为InP（43.12%）＞DbA、BghiP（31.56%，33.92%）＞BaA （30.60%）＞Flt、Pry、Chry、BkF、BaP＞BbF（17.93%）。在J+D+O处理下，10种单个PAH去除率范围为24.34%～35.81%，其中BaA、BghiP、InP的去除率显著高于其他7种HMW-PAHs，分别为35.81%、35.67%、35.79%。与J处理相比，J+D处理下Flt、Chry、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP 7种HMW-PAHs的去除率显著提高，其中BkF的增幅最大，增加了63.78%，表明添加淀粉对不同种类HMW-PAHs的去除促进作用有一定差异；J+D+O处理中10种单个HMW-PAHs去除率比J处理均有显著增加，其中BkF的增幅最明显，增加了68.09%。对比J+D和J+D+O处理不难发现，除BbF外，其余9种PAHs的去除率在两组处理之间差异均不显著，通气对单个HMW-PAH的修复未产生显著影响。

2.2不同处理对土壤酶活性影响的研究

不同处理土壤酶活性的变化见表3。J处理下木质素过氧化物酶活性大于CK，但未达到显著水平，J+ D、J+D+O处理下木质素过氧化物酶活性显著高于CK和J，与HMW-PAHs总量去除率的结果一致，推测土壤HMW-PAHs的降解可能与该酶活性有关，过氧化氢酶活性大小顺次为J+D+O＜J+D＜J＜CK（P＜0.05）。同时，研究两种土壤酶活性与PAHs去除率的相关性（表4）可以看出，土壤过氧化氢酶活性与Chry、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP的去除率呈极显著负相关，与Flt、BaA的去除率呈显著负相关；土壤木质素过氧化物酶活性与Chry、BkF、InP、DbA、BghiP的去除率呈显著正相关。该结果进一步证实了该酶可能与镰刀真菌ZH-H2降解HMW-PAHs的效率有关。

图3　不同措施下固定化ZH-H2菌剂对土壤各HMW-PAHs的去除效果Figure 3 The degradation of individual HMW-PAHs in soil by immobilized ZH-H2 in the different treatments

表3　不同处理下土壤酶活性的测定结果Table 3 Soil enzymatic activities in different treatments

3　讨论

向土壤中添加高效去除菌、高效去除菌载体或者其营养物质等共代谢底物来提高污染物去除效果的方法被称为生物强化［31-32］。本研究采用生物强化的方法向PAHs长期污染土壤中添加玉米秸秆固定化Fusarium.sp修复HMW-PAHs，并结合添加淀粉以及通气措施来提高HMW-PAHs的修复效率。

表4　酶活性与各HMW-PAHs去除率的相关性分析Table 4 The correlation analysis about the soil enzyme activity and the degradation of ten different HMW-PAHs

与课题组前期向土壤中添加0.1 g·kg-1游离菌的研究结果相比，ZH-H2经固定化后显著促进了PAHs的去除。这可能是因为ZH-H2经固定化后单位体积介质中微生物的数量显著增加，增加了ZH-H2与PAHs接触的机会；或者是ZH-H2经固定化后微环境有利于屏蔽土著菌的竞争作用，降低了污染物对ZHH2的毒害作用，使其可以保证高效的修复效果［33］。另外，过氧化氢酶分解土壤中过氧化氢，是H2O2的解毒剂，有利于防止过氧化氢对生物体的毒害作用，可用作PAHs引起的氧化胁迫的生物标志物［34］。本研究土壤过氧化氢酶活性随去除率升高而降低，与王洪等［35］研究得出的PAHs修复效果与过氧化氢酶活性呈负相关结论相一致，可能是由于PAHs或者其中间代谢产物的毒性作用，促使微生物固定化、添加淀粉等措施增强了对ZH-H2的保护作用，导致土壤过氧化氢酶活性降低。

本研究中土培60 d后，固定化ZH-H2、固定化ZH-H2-淀粉处理均能够显著促进固定化Fusarium. sp对HMW-PAHs污染农田土壤的修复。淀粉加强HMW-PAHs去除效果一方面归于淀粉基质可能改善了土壤微生物的营养条件，利于固定化降解菌ZHH2及土著微生物的生长［36］，改变了微生物种群结构，课题组前期已证实淀粉促进Fusarium.sp对HMWPAHs降解的显著效果；另一方面，添加淀粉可能促进了固定化ZH-H2及土著微生物分泌一些关键的去除酶［37］。Wang［38］已证实，P.Chrysosporium分泌的木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是土壤中PAHs去除的主要酶，且其酶活性随着土壤有机质含量的提高而增加，Collybia.sp和Rhizoctonia在土壤多环芳烃修复应用中产生木质素过氧化物酶［39-40］，而且本研究中木质素过氧化物酶活性与Chry、BkF、InP、DbA、BghiP的去除率呈显著正相关。该结果进一步说明不同处理措施对土壤HMW-PAHs的去除影响可能与分泌的木质素过氧化物酶有关；同时，固定化ZH-H2—淀粉处理中过氧化氢酶活性显著低于固定化ZH-H2，也可能是添加淀粉促进了对ZH-H2的保护作用。综合以上两方面因素认为，添加淀粉可能是提升HMWPAHs去除的主要原因。另外，邹德勋等［41］证明通气促进微生物生长，提高了PAHs修复效果，但Teng［23］等却得到了不同的结论，他们发现在通气的处理中，BaP的含量高于未通气处理。在本研究中，通气措施对HMW-PAHs修复的影响也不显著，与Teng等的结论相符，可见，通气对不同菌种降解PAHs的影响差异较大。

在添加淀粉、淀粉-通气两组处理下，6环PAHs总量的去除率均高于4环和5环。一般来说，随着PAHs环数的增加，去除率因其生物可利用性降低而降低。孙铁珩等［42］指出，PAHs的难去除性与其分子量和环数呈正相关性，与本研究结果相反，不过有学者已证明淀粉能够增加BaP的水溶性［43］。这可能是解释本研究结果的重要证据之一。另外，Olivier等［14］也发现，镰刀菌属对5环、6环HMW-PAHs的修复效果高于4环PAHs，与本研究结果一致。这可能与该菌种的去除特性有直接关系。

纵观国内外文献不难发现，添加淀粉伴随通气与固定化Fusarium.sp菌剂相结合修复HMW-PAHs长期老化污染土壤中10种单体的研究尚未检索到相关文献。有学者已证实添加可溶性淀粉促进了土著微生物对BaP的去除效果［20］，但尚未有添加淀粉与固定化Fusarium.sp菌剂相结合的方法用以修复 HMWPAHs长期污染老化土壤的研究。本研究证实了淀粉与固定化Fusarium.sp菌剂相结合措施对6环PAHs有较好的去除效果。

4　结论

（1）添加淀粉能够显著促进固定化ZH-H2菌剂的降解能力，而通气对其降解影响不大。

（2）随着淀粉、通气调控因子的改变，单个HMWPAH的去除能力随之发生了改变。在J+D+O处理下固定化菌剂对BaA、BghiP、InP的修复效果最佳，且对6环PAHs有较好的去除效果，在J+D处理下对InP的去除最高。

（3）不同处理土壤过氧化氢酶和木质素过氧化物酶活性可能影响对HMW-PAHs的去除。

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Effect of starch and aeration addition on degradation of HMW-PAHs by immobilized Fusarium.sp in a polluted and aged soil of a coal mining area

ZHANG Xue-na1，JIA Hai-bin1，LI Cheng3，WANG Wei1，ZHANG Li-xiu1，FENG Sheng-dong1*，YANG Zhi-xin1，2*
（1.College of Resource and Environment Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China；2.Key laboratory for Farm Land Eco-environment，Baoding 071000，China；3.Hebei Institute of Environmental Science，Shijiazhuang 050000，China）

The soil incubation experiment was performed to study the effect of starch and aeration addition on HMW-PAHs degradation by Fusarium.sp in polluted and aged soil of a coal mining area.After 60 days incubation，the degradation rate of 10 HMW-PAHs as well as the change rule of soil enzyme activities were analyzed.The results showed that the treatments were in the following order in terms of∑10 HMW-PAHs degradation rate：immobilized Fusarium.sp+starch+aeration（J+D+O，29.19%）≈immobilized Fusarium.sp+starch（J+D，25.89%）＞immobilized Fusarium.sp（J，16.54%）.There was no significant difference between J+D+O and J+D for the degradation of∑4-rings，∑5-ring and∑6-ring PAHs，but their degradation rates were higher than J significantly（P＜0.05）.The degradation range of 10 individual HMW-PAHs were 9.12%～21.73%，17.93%～43.12%，24.34%～35.79%in J，J+D and J+D+O treatments respectively.The results demonstrated that far higher degradation rates of the 10 individual HMW PAHs were achieved in J+D+O and J+D treatments than those in Jtreatment，but there was no significant difference between J+D+O and J+D.The removal rates of BkF presented the highest increase extent in the two treatments and increased 68.09%，63.78%respectively.In addition，the treatments were in the following order in terms of catalase enzyme activities：CK＞J＞J+D＞J+D+O（P＜0.05）.We found that there were significant（P＜0.05）linear negative correlation between the removal rates of the 10 individual HMW-PAHs and catalase activity in soil.However，the degradation rate of Chry，BkF，InP，DbA，BghiP had significant（P＜0.05）linear positive correlation with lignin peroxidase activity.In conclusion，the individual PAH was removed by different treatments selectively，and the degradation rate were significantly improved by adding starch.

a coal mining area；HMW-PAHs；immobilized Fusarium.sp；starch；aeration；soil enzyme activity

X53

A

1672-2043（2016）09-1709-08doi：10.11654/jaes.2016-0596

2016-04-28

河北省教育厅项目（Z2013058）；863专项（2012AA101403-3）

张雪娜（1990—），女，河北廊坊人，硕士生，主要从事环境质量评价与监控研究。E-mail：815798846@qq.com

杨志新E-mail：yangzhixin@126.com； 冯圣东E-mail：fengshengdong@126.com