陈贤华 胡宏波 冯金 孙秀娟 刘大鹰

[摘要] 目的 探讨Reprimo基因3'非翻译区839位点G>C单核苷酸多态性与肺癌发生的关系。 方法 选取2006年1月～2010年12月于柳州市柳铁中心医院行手术切除或纤维支气管镜检查的肺癌患者36例，取其组织标本，基因分型检测采用MightyAmp DNA聚合酶法，分别检测癌组织（肺癌组）和癌旁正常组织（对照组）的Reprimo基因839位点G>C分布，运用χ2检验和Armitage's趋势检验等分析其与肺癌发生的相关性。 结果 两组标本经哈迪-温伯格平衡检测，对照组在Reprimo基因3'非翻译区839位点G>C基因型观测（理论）频数为0、33、3（7.56、17.88、10.56），差异有统计学意义（P=0.000），肺癌组的基因型观测（理论）频数为6、29、1（11.67、17.65、6.67），差异有统计学意义（P=0.000）；Reprimo基因3'非翻译区839位点G>C多态性与肺癌易感性的Armitage's趋势检验差异有统计学意义（χ2=6.44，P=0.011）。 结论 Reprimo基因3'非翻译区839位点G>C单核苷酸多态性与肺癌发生具有一定相关性。

[关键词] 肺癌；Reprimo；多态性；哈迪-温伯格平衡

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（c）-0035-03

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism and lung cancer. Methods From January 2006 to December 2010， 36 patients with lung cancer in Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital underwent surgery and fiberoptic bronchoscopy were selected. Tissue specimens were collected and genotyping was detected by MightyAmp DNA Polymerase. The Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism was detected in the cancer tissue （cancer group） and para-carcinoma tissue （control group）. The results were analyzed with χ2 test and Armitage's trend test. Results According to Hardy-Weinberg equilibrium detection， 839 G>C genotype observation （theory） frequency was 0， 33， 3 （7.56， 17.88， 10.56） in the control group， with statistically significant difference （P=0.000）； and 6， 29， 1 （11.67， 17.65， 6.67） in the cancer group， with statistically significant difference （P=0.000）. Armitage's trend test revealed statistically significant correlation between 839 G>C single nucleotide polymorphisms and susceptibility to lung cancer （χ2=6.44， P=0.011）. Conclusion This study indicates that there is a certain correlation between the Reprimo gene 3'-untranslated region 839 G>C polymorphism and lung cancer.

[Key words] Lung cancer； Reprimo； Polymorphism； Hardy-Weinberg equilibrium

肺癌的發生、发展过程受遗传和环境两方面的共同影响。Liu等[1]发现在大多数肺癌形成过程，遗传倾向可起到关键性作用。Fasching等[2]报道，遗传多态性存在于人类许多基因，在个体肿瘤易感性方面起关键决定性作用。肺癌的基因易感性主要包括基因多态性（代谢酶、抑癌、修复酶基因）和某些基因的突变缺失[3-4]。本研究主要讨论Reprimo基因3'非翻译区839位点G>C多态性与肺癌易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2006年1月～2010年12月柳州市柳铁中心医院手术或纤维支气管镜（简称“纤支镜”）取得的肺（癌）组织标本，质地良好均一，立即用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋处理，室温保存。其中，肺癌组织（肺癌组）及癌旁正常组织标本（对照组）各36例。对照组是同一肺癌患者远端配对正常肺组织（距肿瘤边界灶≥3 cm）。

1.2 基因检测

1.2.1 标本DNA提取 使用TaKaRa DEXPATR试剂。肺癌标本切片厚度为5 μm，加入TaKaRa DEXPATR试剂提取液0.3 mL，恒温加热器100℃，10 min，低温离心机（4℃，12 000 r/min）立即离心10 min，提取液分3层，吸取中层清晰液体得到PCR扩增用DNA。详细操作请参照说明书进行。

1.2.2 扩增试剂 采用TaKaRa的MightyAmp DNA Polymerase试剂进行扩增Reprimo基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，碱基序列为R1：5'-GCGCAGAACTTTGGAAGCTGC-3'，R2：5'-GCGCAGAACTTT GGAAGCTGG-3'，R3：5'-AGGAGAAGAGTGGGAGCG C-3'；R1R3负责839位点的G片段，扩增产物为235 bp；R2R3负责839位点的C片段，扩增产物为235 bp。

1.2.3 PCR反应体系 25 μL反应体系：2×PCR Buffer 12.5 μL，模板DNA 4 μL，酶（5 U/μL）0.5 μL，引物0.5 μL×2，重蒸水7 μL。体系反应条件：98℃预变性5 min，扩增温度98℃ 10 s、60℃ 1 s、68℃ 1 min，扩增循环40次，68℃延伸4 min；选取10 μL PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增目的基因。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；使用在线软件（http：//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）进行Armitage's趋势检验、哈迪-温伯格平衡检验，计算比值比（OR）及95%可信区间（CI）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般资料

收集36例临床肺癌患者资料，病理分型：鳞癌7例，大细胞癌10例，腺癌9例，小细胞癌10例；其中，女10例，平均年龄为（54.40±9.58）岁，男26例，平均年龄为（58.81±10.42）岁。

2.2 Reprimo产物电泳基因分型

Reprimo基因3'非翻译区839 G>C位点各基因型在琼脂糖凝胶电泳显示的条带分别为GG：235 bp，CC：235 bp。见图1。

2.3 肺癌组和对照组哈迪-温伯格平衡检验

结果显示，对照组和肺癌组在Reprimo基因3'非翻译区839位点基因型和等位基因频率分布不符合哈迪-温伯格平衡规律（P < 0.05）；在肺癌病理分型中腺癌、大细胞癌、鳞癌符合哈迪-温伯格平衡规律（P > 0.05），小细胞癌组接近符合该规律（P=0.045）。见表1。

2.4 Reprimo基因3'非翻译区839位点多态性与肺癌易感性的Armitage's趋势检验

携带G等位基因的患者比C等位基因的患者肺癌发病率更高；携带GG基因型的患者比CC、GC及GC+CC基因型的患者肺癌发病率明显升高，且Armitage's 趋势检验差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，其中在男性中占所有恶性肿瘤的第一位[5]。最新统计预测，美国2015年将会有16万人死于肺癌，肺癌新发病例数为22万例[6]。中国肺癌发病率也呈逐年上升趋势，年平均增长1.63%[7]。不过令人遗憾的是，80%肺癌患者就诊时已属于中晚期，存活率低，但肺癌早期诊治的5年生存率可高达90%[8-9]。因患者肺癌早期症状无特异性，肺癌早期诊治仍待医学界解决。

Reprimo基因为抑癌基因，含有109个氨基酸（相对分子量为12 000），定位在人类染色体的2q23，是一种胞浆糖蛋白[10]，它是p53基因的下游靶基因，可通过控制Cdc2/cyclinB1和Cdc2活性核转位的机制抑制细胞周期[11]。国内外研究Reprimo基因甲基化与肿瘤关系（尤其胃癌方面）的报道很多，其与肿瘤诊治、发生发展方面具有一定的相关性[12-18]。而Reprimo基因多态性与肿瘤方面的报道较少，Ye等[19]报道Reprimo基因在839位点存在基因多态性，并用哈迪-温伯格平衡检验高加索人群，证明该位点符合哈迪-温伯格平衡规律。Beasley等[20]报道Reprimo基因824位点G>C多态性与大肠癌关系时，大肠癌组和健康组在该位点也符合哈迪-温伯格平衡规律，憩室病组在该位点不符合该规律。

本研究显示，对照组和肺癌组在Reprimo基因3'非翻译区839位点基因型和等位基因频率分布不符合哈迪-温伯格平衡规律（P < 0.05）；在肺癌病理分型中腺癌、大细胞癌、鳞癌符合哈迪-温伯格平衡规律（P > 0.05），小细胞癌接近符合该规律（P=0.045）。不符合哈迪-温伯格平衡规律的原因可能为基因分型不明确；基因突变/缺失；样本量不足。

Beasley等[20]在研究Reprimo基因824位点G>C多态性与大肠癌的关系时，发现两者不存在相关性。本研究结果表明，Reprimo基因3'非翻译区839位点基因改变，G等位基因的患者肺癌发病率高于C等位基因的患者，但差异无统计学意义（P > 0.05）；携带GG基因型的患者比CC、GC及GC+CC基因型的患者肺癌发病率明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），显示Reprimo基因3'非翻译区839位点基因变化，患者肺癌发生趋势可呈线性升高。

总而言之，Reprimo基因3'非翻譯区839位点G>C单核苷酸多态性与肺癌的发生具有一定相关性，尤其是携带G等位基因、GG基因型的患者更有可能发展成肺癌。本文不足：该位点基因研究不能解释Reprimo基因所有位点的功能特性，且实验过程中标本数量有限，在以后相关研究中需增加标本数量和其他位点功能研究，以明确Reprimo基因单核苷酸多态性在肺癌诊治中的作用。

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（收稿日期：2015-12-20 本文編辑：程 铭）