张　杰

(周口师范学院 生命科学与农学学院， 河南 周口466001)



气升挡板式厌氧生物反应器适合醋酸菌的厌氧环境

(周口师范学院 生命科学与农学学院， 河南 周口466001)

新设计的气升挡板式厌氧生物反应器，具有精确的循环通路，可以培养测验厌氧微生物. 该生物反应器促使细胞暴露在厌氧环境中，通过CO2循环实现厌氧环境. 在新的气升挡板式厌氧生物反应器中培养醋酸菌时，醋酸菌的生物产量是对照生物反应器的1.3倍. 培养200 h时，总酸的产量是对照生物反应器的1.2倍. 该反应器用于厌氧醋酸菌培养时优于普通生物反应器.

醋酸菌；气升式厌氧反应器；滞留效应；气体分散挡板

厌氧微生物可以生产多种有用的复合物，可以降低空气中二氧化碳. 由于厌氧生物反应器发展滞后只有少数厌氧微生物被商业化培养[1]. 厌氧微生物在可持续的生产技术中具有重要角色[2]. 厌氧微生物及其产物的浓度和产量在普通生物反应器中的获得量较低, 其中一个主要原因就是不能有效地提供厌氧环境[3]. 限制其生产量的其他因素包括：传统的气升式生物反应器不能有效抑制氧的聚集；通过呼吸作用消耗的培养基不能有效转化为产物；CO2和培养基营养物质不能充分混合；反应器部分区域形成搅拌死角.

在合适的厌氧环境中，如果醋酸菌细胞能够在气升挡板式厌氧生物反应器的内部和外部气体分散孔处反复循环就能加强培养基的有效转化. 这种增强效应就是CO2的循环滞留效应[4- 5]. 随意的循环滞留不能增强转化效率. 虽然很多气升式厌氧生物反应器利用循环滞留增强发酵物种的转换效率[6]，但是都没有能开发出一种有效的CO2循环模式. 笔者报道了一种新的气升挡板式厌氧生物反应器，利用CO2的循环效应可以增强醋酸菌细胞生物量和发酵产物的产率. 该气升挡板式厌氧生物反应器遵循气升原理，用气体分散孔的作用增加了CO2的路径，调整了醋酸菌的厌氧环境.

1　材料与方法

1.1微生物和测试指标

醋酸菌(宋河酒业窖池中分离)来自周口师范学院白酒联合发酵实验室. DS培养基(后补磷和氮)培养醋酸菌. 后期磷和氮的补充量为5 g/L KNO3，0.75 g/L K2HPO4，初始 pH值为7.0.

醋酸菌浓度由α-1900S系列双光束扫描型紫外可见分光光度计测得625 nm OD值确定.

乙酸的测定：根据GB 5413.34-2010测定.

总酸的测定：根据GB/T 12456-2008测定.

pH值的测定用pH计.

醋酸菌的CO2补偿和CO2饱和点的确定方法：40 mL的稀释细胞悬液 (光吸收值0.1) 置于250 mL的摇瓶中培养，利用中和法测定水中游离二氧化碳.

以上各个实验均重复3次.

1.2气升挡板式厌氧生物反应器设计

气升挡板式厌氧生物反应器由玻璃做成，顶部配置各种传感器，小导管位于反应器的一侧(图1A). 上升气体被气体分散孔均匀输送到分隔的区域. 气体分散孔挡板(图1B)固定在同一中心轴承上，上升区域输进压缩的CO2. 液体在分隔的区域内形成涡流，这样带动细胞在狭窄的气体分散孔挡板区域和孔区域交替运动 (图1C)，分别用有气体分散挡板和无气体分散挡板两种不同生物反应器测试其效应. 循环冷却水通过固定在反应器前方的透明套管控制温度，温度和pH感应器置于反应器的顶部，邻接在气体出口.

图1A气升挡板式厌氧生物反应器结构示意图；B气升挡板式厌氧生物反应器气体分散挡板；C 气体分散效应示意图.

1.3培养物在气升挡板式厌氧生物反应器中的生长

为获得一定浓度的种子，醋酸菌接种在带有蠕动泵的环管反应器中，培养过程中用空气压缩机输入CO2. pH值根据需求通过注入CO2的方法控制在7 ± 0.1的范围内. 醋酸菌在接种到气升挡板式厌氧生物反应器之前，需要生长到 15～20 OD.

1.4醋酸菌产率和pH值评价气升挡板式厌氧生物反应器的性能

醋酸菌的生长实验分别在气升挡板式厌氧生物反应器和具有相同体积及形状的柱状3.0 L反应器(对照)中完成. 最终以醋酸菌的产率和反应产物为评价标准，进而确定反应器的优劣. 培养过程如下：反应器用3%的过氧化氢过夜灭菌，然后用无菌水冲洗3次. 醋酸菌在反应器中生长从起始光密度3.5到最终光密度11 ± 1. 在每次实验之前，将醋酸菌的OD值稀释到3.5. 通过逐步调节CO2流量，直到匹配的培养要求. 当CO2流量到达0.7 L/s的时候为最佳，故采用的CO2流量为0.7 L/s，温度为37 °C，pH为7 ± 0.1，通过感应器控制.

2　结果与分析

2.1醋酸菌的生长曲线

醋酸菌的生长速率和CO2流速之间的关系如图2所示. 由图2可以看出CO2补偿点为0.125 L/ s，CO2饱和点约为0.75 L/s，最大生长速率为0.125 OD/h. 这些结果显示：通过调节CO2在生物反应器中变化可以控制醋酸菌的生长，同时避免CO2抑制现象的出现.

图2　醋酸菌和CO2流速之间的关系

2.2醋酸菌在气升挡板式厌氧生物反应器和普通反应器中的培养和生产率

图3A 醋酸菌在气升式厌氧反应器中的生长曲线图；B醋酸菌在气升式厌氧反应器中乙酸产量曲线图

醋酸菌在气升挡板式厌氧生物反应器和普通反应器中的生产率如图3A所示. 气升挡板式厌氧生物反应器单位体积的生产量是普通生物反应器的1.3倍. 他们的最大生产率分别是1.2和0.9 OD，具有显著性差异(P<0.05). 按0.5 g/L培养基干重计算，气升挡板式厌氧生物反应器和普通反应器的醋酸菌菌体的生产效率分别是2.4%和1.8%. 乙酸的产量在200 h时达到最大(图3B)，气升挡板式厌氧生物反应器和普通反应器中的产量分别为70和60 mg/100 mL. 因为操作条件和反应器体积都是一致的，他们只有气体分散挡板的差别，故所显示的结果表明气升挡板式厌氧生物反应器生产率的提高是由于安装了气体分散挡板缘故.

2.3气升挡板式厌氧生物反应器中CO2对总酸和pH值的影响

图4培养过程中总酸和pH值的变化

醋酸菌在气升挡板式厌氧生物反应器和普通反应器中的总酸和pH值的变化如图4A和4B所示. 总酸最大生产量分别是98.2和80.0 mg/100 mL. 气升挡板式厌氧生物反应器单位体积的总酸生产量是普通反应器的1.2倍(图4A). 醋酸菌在气升挡板式厌氧生物反应器中耐酸性更强，其生长环境的酸度比普通反应器中的高(图4B). 上述结果表明气升挡板式厌氧生物反应器生产的总酸量高于普通生物反应器，并且为醋酸菌的生长提供了一个更好的酸性驯化环境.

3　讨论

在一个厌氧有限的反应器中，厌氧环境越优越，厌氧细胞密度就越高，单位体积的生产率就越高[6]. 安装气体分散挡板提高生产率的原因有以下几个方面:(1)气体分散挡板提高了CO2在生物反应器中的滞留时间，进而影响CO2和氧的转换速率. 氧的积累减少和CO2的增多能够满足醋酸菌的厌氧需求. 但是这样并不能完全解释气体分散挡板反应器就可以具有较高的生产效率. (2)气体分散挡板增强了培养基的混合性. 然而两个反应器都能够提供充分的混合为细胞提高充足的养分. 事实上，在生物量很低的时候，两个反应器的生产率是相似的(图2A). 因此气体分散挡板提供可溶解的养分并不能解释两个反应器生产率差异的原因. 因为氮和磷是超量添加的，故营养限制被排除，并且早期的实验中，同样的培养基中可以获得相似的产率和产物. 气升挡板式厌氧生物反应器比普通反应器效果较好的唯一原因是培养基和CO2的浓度变得更均匀. 例如，一定体积空间培养基和CO2更能均匀分散，在这样的区域混合能使其效果更好，CO2的滞留时间更长. 在普通反应器中，培养基和CO2的混合区域无序运动的，并且没有有效的滞留时间. 气升挡板式厌氧生物反应器的气体分散挡板为醋酸菌提供了CO2滞留与分散效应.

在醋酸菌培养时没有检测到一系列关于CO2和O2抑制现象. 显微检测显示没有细胞器损害，没有明显的膜破损和细胞凋亡现象. 在醋酸菌批量培养的后期检测到一些异味气体，表明厌氧效应不够完美[7]，在普通反应器中早期检测到细胞凋亡现象.

精确的CO2-培养基混合模式通过滞留效应增强醋酸菌的产率是必要的. 相反，杂乱的CO2-培养基混合模式不能有效地增强醋酸菌的产率.

[1]Anzola Rojas, Zaiat M. A novel anaerobic down-flow structured-bed reactor for long-term stable H-2 energy production from wastewater[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2016， 91(5): 1551-1561.

[2]Frey B, Rime T, Phillips M, et al. Microbial diversity in European alpine permafrost and active layers[J]. Fems Microbiology Ecology, 2016，92(3):1-3.

[3]Ramansu Goswami, Pritam Chattopadhyay, Arunima Shome, et al. An overview of physico-chemical mechanisms of biogas production by microbial communities: a step towards sustainable waste management[J]. Biotech, 2016， 6:7.

[4]Lindsay N Clothier, Lisa M Gieg. Anaerobic biodegradation of surrogate naphthenic acids[J]. Water Research, 2016， 90: 56-166.

[5]YUAN Guanghuan, ZHOU Xingqiu, WU Jiandong. Enhancing anaerobic digestion of lignocellulosic materials in excess sludge by bioaugmentation and pre-treatment[J]. Waste Management, 2016， 49: 55-63.

[6]Zahedi S,Solera R,Micolucci F, et al. Changes in microbial community during hydrogen and methane production in two-stage thermophilic anaerobic co-digestion process from biowaste[J]. Waste Management, 2016，49: 40-46.

[7]Fenghao Cui, Kyung Mo, Seyong Park, et al.Comparative Study on SBNR, GSBR and Anammox for Combined Treatment of Anaerobic Digester Effluent[J]. Ksce Journal of Civil Engineering, 2016，20(2): 590-596.

A airlift anaerobic bioreactor with scattering baffle are benefit for anaerobic environment of vinegar organism

ZHANG Jie

(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001,China)

A newly developed airlift anaerobic bioreactor with air hole and circulatory pathway was tested for anaerobic microorganism. The airlift anaerobic bioreactor provide anaerobic environment for cells by loop of CO2. The production of vinegar organism is 1.3 times higher than the common bioreactor. The production of total acid is 1.2 times higher than the control after culturing 200 h. The above results showed that the newly developed airlift anaerobic bioreactor performance prior to the common bioreactor in culturing vinegar organism.

vinegar organism;airlift anaerobic bioreactor;retention effect;air scattering baffle

2016-05-22;

2016-06-25

河南省教育厅自然科学资助项目(No.2011B180061);(No.2011-zknufh-01);(No.2011B180058)

张杰(1975- ), 男, 河南太康人, 博士研究生，讲师,主要研究方向:分子生物学与生物工程.

TP391

A

1671-9476(2016)05-0117-03

10.13450/j.cnki.jzknu.2016.05.030