阴离子交换色谱-荧光检测法测定人体血清中酪氨酸及其代谢产物

2016-10-15刘俊俊鄢爱平王晓芬万益群

分析科学学报 2016年2期

刘俊俊，鄢爱平，王晓芬，郭岚，万益群*，

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

酪氨酸(Tyr)是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一，它属于芳香族氨基酸，亦是人体的半必需氨基酸[1,2]。对羟苯基乳酸(PHPLA)、对羟苯基丙酸(PHPA)是Tyr的重要代谢产物，包含一系列的信号分子：神经递质、神经调节物质和营养因素。这些物质的分布和含量与人的行为、功能和病理状态等密切相关[3]。研究表明，Tyr的代谢异常可导致多种氨基酸代谢疾病[4,5]、神经系统变性性疾病[6]、恶性肿瘤[7,8]等。因此，对人体体液中Tyr及其代谢产物的研究，可在临床方面为疾病，特别是肿瘤的早期诊断和病理学研究提供重要的参考依据。

目前，Tyr的研究较为深入，但其代谢产物的研究相对较少。分析方法主要有分光光度法[9]、液相色谱法[10 - 12]、毛细管电泳法[13]、气相色谱法[14 - 16]等。离子色谱法(IC)因其灵敏度和分离效率高，且流动相简单、环保而备受关注。本文采用阴离子交换色谱-荧光检测法(IEC-FLD)，系统地探讨了Tyr、PHPLA和PHPA的分离分析条件，建立了人体血清中上述三种化合物同时分析新方法，为Tyr及其代谢产物的临床研究提供了方法学参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-2500型离子色谱仪(美国，Dionex公司)，包括GP50四元梯度泵、LC25色谱柱箱、FLD-3000荧光检测器和Chemeleon6.8色谱工作站；F-4500型荧光光度计(日本，日立公司)；Milli-QS超纯水装置(美国，Millipore公司)；AP210电子天平(美国，Ohaus公司)；MS2迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)；TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

酪氨酸(Tyr,纯度>99%)、对羟苯基丙酸(PHPA,纯度>98%),购于美国Acros Orgnics公司；对羟苯基乳酸(PHPLA,纯度>98%)购于美国Sigma公司；50% NaOH溶液(Sigma Aldrich)。实验用水为超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2 血清样本的采集与处理

1.2.1血清样本的采集早晨7～8时，抽取人体空腹时静脉血5 mL(n=12，血样分别来源于南昌九四医院和北京大学深圳医院)，置于采血管中，之后将所采血样于常温下3 000 r/min离心10 min，上层血清用于分析检测。

1.2.2血清样本前处理取血清500 μL于1.5 mL离心管中，加等体积的乙腈，之后于MS2迷你振荡器以3 000 r/min转速混匀1 min，室温静置10 min，再以12 000 r/min的转速离心10 min。取上清液，过0.22 μm水系滤膜后，进样分析。

1.3 色谱分析条件

色谱柱：IonPac AG21保护柱(50×2 mm)，IonPac AS21分析柱(250×2 mm)；柱温：35 ℃；淋洗液：4 mmol/L NaOH；流速：0.45 mL/min；进样体积：25 μL。荧光分析条件：激发波长277 nm，发射波长340 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

本文分别考察了AS18阴离子交换柱(IonPac AS18)与AS21阴离子交换柱(IonPac AS21)对目标物的分离情况。采用IonPac AS18分离柱，流动相为30 mmol/L NaOH溶液，三种物质分离良好，保留时间在20 min之内，但分析物荧光响应信号较弱；IonPac AS21分离柱较IonPac AS18分离柱对各物质的保留能力弱，NaOH溶液浓度为4 mmol/L时，各物质已完全分离，且荧光信号增强，因为三种物质对pH值的变化比较敏感，pH值增大，物质的荧光响应降低，如图1所示。因此，本文选择IonPac AS21分离柱、4 mmol/L NaOH溶液对目标化合物进行分离。同时考察了淋洗液流速对目标物分离效果的影响。结果表明，流速增大，物质的出峰时间缩短，且信号响应也相应增强，在柱压允许范围内，本文选定流速为0.45 mL/min，三种分析物在20 min内完全分离。在优化条件下，Tyr、PHPLA和PHPA色谱分离图见图2。

2.2 荧光波长的选择

配制Tyr、PHPLA和PHPA浓度均为1.0 mg/L溶液，在荧光光度计上对各物质的激发和发射光谱进行扫描，得到各物质的最大激发和最大发射波长分别为λex=277 nm、λem=306 nm。但因为该激发和发射波长比较接近，Raleigh散射现象较为严重，使得离子色谱中噪音较高，灵敏度降低。若增大发射波长，可以降低噪音，但物质的荧光强度减弱，检出限也发生了相应变化。实验中固定激发波长λex=277 nm，对不同发射波长(λem)条件下各物质的检出限做了比较，结果如图3所示。结果表明，当λex=277 nm、λem=340 nm的条件下各物质的检出限相对较低。

2.3 样品前处理条件的选择

人血清中含有大量蛋白质，如果直接进样分析会影响色谱柱柱效及其寿命[17]，故去除血清中的蛋白质很有必要。本文分别考察了甲醇和乙腈沉降蛋白的效果。结果表明：以甲醇为沉淀剂，沉降蛋白效果较差；以乙腈为沉淀剂，蛋白质除去较为完全，满足实验要求。因此本实验选择乙腈为血清蛋白沉淀剂。

2.4 干扰实验

2.5 线性方程、线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的Tyr及其代谢产物混合标准工作溶液，在已优化的色谱分析条件下，以峰面积(A)对浓度(c)进行线性拟合，结果见表1。结果表明，Tyr、PHPLA和PHPA分别在0.30～25 mg/L、0.025～2 mg/L和0.025～2 mg/L的范围内线性关系良好，测得三种物质的检出限(以S/N=3计)分别为0.024 mg/L、0.020 mg/L、0.019 mg/L。

表1 酪氨酸及其代谢产物的线性方程、相关系数及检出限

2.6 回收率和精密度

为了考察方法的准确度及精密度，在乳腺癌患者血清样品中添加了3个不同水平的Tyr、PHPLA和PHPA混合标准溶液进行加入回收试验，每个水平平行测定6次，结果见表2。三种物质的加标回收率在72.6%～99.1%之间，相对标准偏差(RSD)在1.27%～6.62%之间，表明该方法准确可靠，可满足实际样品的测定要求。