何　珊　刘迎春　李玲瑶　梁　玮　高　峰*

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018；2.内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特010018；3.内蒙古生物制造重点实验室，呼和浩特010018)



妊娠后期胎儿宫内生长受限对蒙古绵羊胎儿肝脏细胞外基质合成的影响

何珊1刘迎春2,3李玲瑶1梁玮1高峰1*

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018；2.内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特010018；3.内蒙古生物制造重点实验室，呼和浩特010018)

本试验旨在研究妊娠后期胎儿宫内生长受限(IUGR)对蒙古绵羊胎儿肝脏细胞外基质合成的影响。选择健康的、经同期发情和受孕的蒙古绵羊18只，随机分为3组，代谢能水平分别为0.175(R1组)、0.330(R2组)和0.670 MJ/(kg BW0.75·d)(自由采食组，C组)，每组6个重复，每个重复1只羊。妊娠140 d时屠宰母羊，测定胎儿肝脏实质细胞数量及细胞外基质含量。结果表明：R1组胎儿肝脏重(P<0.01)、肝细胞数(P<0.05)、肝细胞核直径(P<0.01)以及Ⅰ型胶原(P<0.01)、Ⅲ型胶原(P<0.05)、Ⅳ型胶原(P<0.01)、层黏连蛋白(P<0.01)、透明质酸(P<0.05)、纤连蛋白含量(P<0.01)显著或极显著低于C组，且内皮细胞数显著高于C组(P<0.05)；R2组胎儿肝脏重(P<0.05)、纤连蛋白含量(P<0.01)显著或极显著低于C组，而内皮细胞数显著高于C(P<0.05)。结果提示，妊娠后期营养限饲蒙古绵羊严重限制其胎儿肝脏生长发育，代谢能水平为0.175 MJ/(kg BW0.75·d)时，胎儿肝脏细胞外基质合成受到了严重影响，且发生肝纤维化修复反应；代谢能水平为0.330 MJ/(kg BW0.75·d)时，仅有胎儿肝脏纤连蛋白含量发生改变。

营养限饲；胎儿肝脏；肝内实质细胞；细胞外基质

宫内生长受限(intrauterine growth retardation,IUGR)又称胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)，指胚胎期自身体重或器官未达到遗传的生长潜能而导致胎儿及其器官生长发育迟缓[1]。IUGR绵羊胎儿的肝脏不可避免地存在先天性不足，且显著影响肝脏后天的生长发育和生理功能[2]。肝脏作为机体功能性脏器，许多功能受细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成的影响[3]。ECM在生物组织的构建、细胞极性的维持及胚胎发育、细胞分化都起到重要作用[4]。ECM主要包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、透明质酸、层黏连蛋白、纤连蛋白等[5]。肝脏损伤导致ECM分泌减少，ECM的代谢发生紊乱是肝纤维化发生的基础[6]；ECM分泌变化导致的并发症常造成围产期或婴儿早期的死亡[7]。鉴于ECM对于肝脏疾病各个阶段都发挥重要作用，深入研究妊娠后期IUGR对于胎儿肝脏ECM合成影响有利于早期肝病的预防，提高出生率。本试验旨在研究妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏ECM合成的影响，为控制妊娠期胎儿肝脏ECM合成与降解处于平衡状态的研究和科学的母羊妊娠期饲养管理提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1试验动物与饲养

选择体况中等、2～3胎次，经同期发情和受孕(Medison-SA-600 B超仪分析确定均为单胎)的健康蒙古绵羊18只，按体重随机分为3个组，代谢能水平分别为0.175(限饲1组，R1组)、0.330(限饲2组，R2组)和0.670 MJ/(kg BW0.75·d)(自由采食组，C组)，每组6个重复，每个重复1只羊。采用自制人工套袋罩在各限制组母羊嘴部供青干草，适应1周后，按照设定饲喂量供给；C组自由采食。所有试验羊08:30、16:00共饲喂2次；C组11:00加喂1次以保证充分采食。各组自由饮水，自由舔食盐砖。每天采集采食饲草、剩草样，然后混合，供营养水平测定[8]。饲草及营养物质采食量、采食饲草及剩料的营养水平见表1。

表1　饲草及营养物质采食量、采食饲草及剩料的营养水平(饲喂基础)

1.2屠宰方法

妊娠140 d将每组6只母羊屠宰，母羊屠宰前，禁饲24 h，禁水15 h，称宰前活重。剥皮后沿腹中线开膛，取出胎儿，随即完整取出胎儿肝脏，称重，-80 ℃保存待测。

1.3胎儿肝脏内实质细胞数量的测定

在肝门部切开肝脏，取最大切面处1 cm×1 cm×1 cm肝脏组织样本做成石蜡切块，用切片机做成切片，采用苏木精-伊红(HE)染色，40×下选取11个不同视野进行拍照计数，利用专业图像分析软件Image-pro Plus 6进行肝细胞数、肝细胞核直径、内皮细胞数、枯否氏细胞数测定。

1.4胎儿肝脏ECM的测定

取上述各组胎儿肝脏组织0.5 g左右，于9倍体积的0.85%冷生理盐水匀浆，3 000 r/min离心15 min后，取上清液，采用酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定胎儿Ⅰ型胶原(H142)、Ⅲ型胶原(H144)、Ⅳ型胶原(H145)、层黏蛋白(H148)和透明质酸(H141)含量，严格按照说明书测定各项指标。

1.5数据处理

所有数据采用SAS 9.0一般线性模型统计分析，采用Duncan氏法进行多重比较。

2　结　果

2.1妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏重的影响

妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏重影响见表2。妊娠140 d时，R1组胎儿体重、肝脏重极显著低于C组(P<0.01)，且2组间肝脏重/体重差异不显著(P>0.05)；R2组胎儿体重(P<0.01)、肝脏重(P<0.05)显著或极显著低于C组，且2组间肝脏重/体重差异不显著(P>0.05)。

表2　妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿体重、肝脏重和肝脏重/体重的影响

同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏内实质细胞数量的影响

妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏内实质细胞数量的影响见表3。妊娠140 d时，R1组胎儿肝细胞数(P<0.05)、肝细胞核直径(P<0.01)显著或极显著低于C组，内皮细胞数显著高于C组(P<0.05)，且2组间枯否氏细胞数差异不显著(P>0.05)；R2组胎儿肝脏的内皮细胞数显著高于C组(P<0.05)，且2组间肝细胞数、肝细胞核直径、枯否氏细胞数差异均不显著(P>0.05)。

表3　妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏内实质细胞数量的影响

2.3妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏ECM含量的影响

妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏ECM的影响见表4。妊娠140 d时，R1组胎儿肝脏Ⅰ型胶原(P<0.01)、Ⅲ型胶原(P<0.05)、Ⅳ型胶原(P<0.01)、层黏连蛋白(P<0.01)、透明质酸(P<0.05)、纤连蛋白含量(P<0.01)均显著或极显著低于C组；R2组胎儿肝脏纤连蛋白含量显著低于C组(P<0.01)，但2组间Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原，层黏连蛋白、透明质酸含量差异均不显著(P>0.05)。

3　讨　论

机体正常生长发育表现为细胞的正常增殖，包括细胞数量、体积的增加。肝脏作为机体重要的内分泌器官，其基本的结构单位是肝小叶，肝小叶主要由肝细胞构成，占了肝小叶体积的75%。除肝细胞外，肝小叶内的其他细胞统称血窦细胞，包括内皮细胞、肝巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞和肝星状细胞等[9]。机体及其器官构成的基本单位是细胞，研究表明，IUGR会严重影响胎儿体重和肝脏重量，导致细胞大小和细胞数量显著降低[10]；且母体营养受限会导致胎儿供给能量不足，体重和肝脏的生长、发育调节和生理功能不可避免地受到影响[2]。本试验条件下，严重限制了R1和R2组胎儿体重及肝脏重的增长，肝脏发育受阻这与高峰[11]报道的结果一致。随着营养水平的降低对胎儿肝脏组织细胞增殖和体积增大的影响逐步加深，可能是IUGR胎儿体重及肝脏重降低的主要原因[10,12-13]。R1组胎儿肝细胞数、肝细胞核直径显著或极显著低于C组，表明妊娠后期IUGR绵羊胎儿肝细胞增殖能力降低，阻碍了细胞体积的增大，不同程度修改了胎儿肝脏的生长发育轨道[14]，可能是导致肝细胞数和体积降低的重要原因。另外，R1、R2组内皮细胞数显著高于C组，肝代谢功能主要体现于肝细胞功能[15]，肝损伤时肝细胞、枯否氏细胞分泌内皮细胞特异性生长因子，促进肝窦内皮细胞增殖[16]。本试验结果表明，随着母体受限制程度加深胎儿肝脏结构与功能受到不同程度影响，且与张崇志[14]的研究结果一致。

表4　妊娠后期IUGR对蒙古绵羊胎儿肝脏细胞外基质含量的影响

ECM不仅仅是支持组织,而且是供给营养和免疫应答的场所,适应外界环境和维持内部环境[17]。ECM主要由肝细胞、内皮细胞合成分泌[3]，包括胶原蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原)、蛋白多糖(透明质酸)、糖蛋白(层黏连蛋白、纤连蛋白)等[18]。胶原蛋白为生物体提供了一种机械支撑作用，维护器官与组织的完整性，保障其正常功能的行使[19]，且Ⅳ型胶原与层黏连蛋白共同构成基膜，起到ECM与外界进行物质交换作用[20]。透明质酸可以阻止细胞中一些酶的产生,减少自由基的形成,防止自由基破坏细胞结构[21]。层黏连蛋白在胚胎发育中发挥着决定性作用，其减少可能是某些疾病的发病基础[22]。且ECM成分与细胞生长和分化等多种细胞生命活动密切相关,对细胞的增殖与分化起着十分重要的调节作用[23]。本试验条件下，R1组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸、纤连蛋白含量均显著或极显著低于C组，且R2纤连蛋白含量显著低于C组，表明妊娠后期营养限饲使胎儿肝细胞数减少，导致ECM合成降低[24]。层黏连蛋白在胚胎发育中起重要作用，维持细胞及器官形态，调节细胞增殖及分化，且主要由上皮细胞和内皮细胞合成，IUGR导致肝脏内皮细胞数降低，可能是影响层黏连蛋白合成降低的重要原因[22]。ECM及其组分的变化可能影响动物脂肪细胞体积、数量和形态等方面的变化[23]，表明纤连蛋白是能量限制ECM合成中早期监控的重要指标。肝脏损伤会使ECM分泌降低，一方面营养限制导致ECM合成能力下降，另一方面，胎儿启动肝纤维化修复反应[25]。胎儿ECM降解大于合成能力，平衡被打破，且可能导致进一步纤维化[26]。肝实质细胞损害，通过旁分泌途径使肝细胞活化和增殖，形成肝纤维化[27]。肝纤维化与ECM分泌密切相关，本试验中，重度纤维化组织中层黏连蛋白含量升高不明显，与张崇志[14]研究结果一致，可能由于机体修复能力降低所导致。

4　结　论

妊娠后期营养限饲蒙古绵羊严重限制其胎儿肝脏生长发育，代谢能水平为0.175 MJ/(kg BW0.75·d)时，胎儿肝脏ECM合成受到了严重影响，且发生肝纤维化修复反应；代谢能水平为0.330 MJ/(kg BW0.75·d)时，仅有纤连蛋白含量发生改变。

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*Corresponding author, professor, E-mail: gaofeng1994@sina.com

(责任编辑王智航)

Effects of Fetal Intrauterine Growth Retardation during Late Pregnancy on Extracellular Matrix Synthesis in Fetal Liver of Mongolia Sheep

HE Shan1LIU Yingchun2,3LI Lingyao1LIANG Wei1GAO Feng1*

(1. College of Animal Science, Inner Mongolian Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Life Science, Inner Mongolian Agricultural University, Hohhot 010018, China; 3. Inner Mongolia Key Laboratory of Bio-Manufacturing, Hohhot 010018, China)

This study investigated the effects of fetal intrauterine growth retardation (IUGR) during late pregnancy on extracellular matrix synthesis in fetal liver of Mongolia sheep. Eighteen healthy Mongolia sheep with synchronization of estrus and conception were allocated to three groups with 6 replicates per group and 1 sheep per replicate. Metabolizable energy (ME) level was 0.175 (R1 group), 0.330 (R2 group) and 0.670 MJ/(kg BW0.75·d) (Adlibitumgroup, C group), respectively. At day 140 of gestation, ewes were slaughtered to determine parenchyma cell number and extracellular matrix contents in liver of their fetuses. The results showed that liver weight (P<0.01), liver cell number (P<0.05), liver cell nucleus diameter (P<0.01), and the contents of collagen type Ⅰ(P<0.01), collagen type Ⅲ(P<0.05), collagen type Ⅳ (P<0.01), laminin (P<0.01), hyaluronic acid (P<0.05) and fibronectin (P<0.01) in fetal liver of R1 group were significantly lower than those of C group, and endothelial cell number in fetal liver was significantly higher than that of C group(P<0.05); significantly higher fetal liver weight (P<0.05) and fibronectin content (P<0.01) were founded in R2 group compared to C group, and endothelial cell number in fetal liver was significantly enhanced in R1 group compared to C group (P<0.05). The results indicate that nutrition restriction during late pregnancy of Mongolia sheep restricts growth and development of fetal liver, and a serious impact on the synthesis of extracellular matrix is found when ME level is 0.175 MJ/(kg BW0.75·d), and liver fibrosis repair reaction also occurs; only the change of fibronectin content in liver fetal is found when ME level is 0.330 MJ/(kg BW0.75·d).[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2749-2754]

nutrition restriction; fetal liver; liver parenchyma cell; extracellular matrix

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.012

2016-03-09

国家自然科学基金(31260559,31460612)；内蒙古自然科学基金杰出青年项目(2013JQ02)；内蒙古自治区青年创新人才项目——“草原英才”工程后备人才选拔计划

何珊(1987—)，女，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，从事反刍动物营养研究。E-mail: 15690992928@163.com

高峰，教授，硕士生导师，E-mail: gaofeng1994@sina.com

S826

A

1006-267X(2016)09-2749-06