曾志恒，曾辉,2，程翊，杨雷，谢神斌，戴建清

（1. 福建省农业科学院食用菌研究所，特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350014；2. 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130018）

双孢蘑菇液体菌种应用研究初探*

曾志恒1，曾辉1,2，程翊1，杨雷1，谢神斌1，戴建清1

（1. 福建省农业科学院食用菌研究所，特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350014；2. 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130018）

对双孢蘑菇新菌株W38液体菌种在栽培种生产中的应用做了初步研究。液体菌种为原种转接固体培养基培养，以固体菌种为对照，进行对比试验，结果表明：液体菌种在PDA上的菌丝生长速度与固体菌种的差异不显著(P＞0.05)；在麦粒培养基中的菌丝生长速度与固体菌种的差异不显著(P＞0.05)，但满袋时间短于固体菌种，两者的差异极其显著(P＜0.01)。在实验室条件下，以液体菌种为原种扩繁袋装麦粒栽培种的接种量为10mL，菌丝萌发率达100%；采用恒流泵接种方式接种效率最高，达到300袋·h-1；栽培种的成品率达到98%，比固体菌种为原种扩繁栽培种的成品率96%高，但两者的差异不显著(P＞0.05)；液体菌种扩繁栽培种的平均单产14.52kg·m-2，较固体菌种扩繁栽培种的平均单产14.49kg·m-2高，两者的差异不显著(P＞0.05)。双孢蘑菇液体菌种在栽培种生产上具有良好的应用前景。

双孢蘑菇；液体菌种；生产应用

食用菌液体菌种以其具有培养时间短、发菌快、菌龄整齐一致、接种方便等优点，并有利于规模化、工厂化生产，越来越受到科研单位、生产企业的青睐，已成为食用菌制种的发展趋势［1］。当前，我国双孢蘑菇制种工艺主要采用固体菌种逐级扩繁生产母种、原种和栽培种［2］。随着食用菌工厂化生产的发展，越来越多生产企业采用液体菌种进行食用菌生产，并在金针菇、杏鲍菇等食用菌工厂化生产中取得成功［3-4］。对双孢蘑菇液体菌种的研究多数是集中在发酵工艺的报道［5］，对液体菌种的应用研究也只见韩文清等［6］的再固化应用研究。文章以双孢蘑菇液体菌种为原种扩繁栽培种，以固体菌种为对照，对菌种活力、萌发率、菌丝走菌速度、接种方式及出菇试验进行对比研究，以期为双孢蘑菇液体菌种在栽培种生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

双孢蘑菇新菌株W38，由福建省农业科学院食用菌研究所提供。

1.2 液体培养基配方

1.2.1 摇瓶种子培养基

马铃薯100g. L-1，麸皮50g. L-1，红糖10g. L-1，蛋白胨2g . L-1， MgSO4·7H2O 0.75 g . L-1，KH2PO4 2.0 g . L-1, VB110 mg . L-1。

1.2.2 液体菌种培养基

小米粉49.90 g . L-1，黄豆粉13.60 g . L-1，KH2PO4 2.00 g . L-1，MgSO4·7H2O 1.0675 g . L-1，pH 6.5。

1.3 固体培养基配方

1.3.1 麦粒菌种培养基

小麦 98%，石膏粉 2%，含水量45%±1%，pH 7.5-8.0。

1.4 实验仪器

电子分析天平、SW-CJ-2F洁净工作台、BSDYX2200恒温摇床、SPX-250B-Z生化培养箱和BF400H/YZ25Ⅱ恒流泵

1.5 试验方法

1.5.1 菌种活化

在无菌操作条件下，从保藏的斜面双孢蘑菇菌种中，切出0.2cm×0.5cm大小的菌块接种于PDA斜面，在生化培养箱中24 ℃培养20d。

1.5.2 摇瓶种子的培养

将活化双孢蘑菇菌株试管母种切割成0.5cm×0.5cm大小的菌块，转接到250mL三角瓶中的100mL灭菌摇瓶种子培养基上，每瓶三角瓶接4块菌块，静置培养2d后，在培养温度24℃、摇瓶转数180r.min-1的恒温摇床中旋转振荡培养10d，得到双孢蘑菇摇瓶种子。

1.5.3 液体菌种的培养

在无菌操作条件下，将双孢蘑菇摇瓶种子用组织捣碎机匀浆。250mL三角瓶装入液体原种培养基100mL，灭菌后接入5 % (V/V)摇瓶种子，在培养温度24 ℃、摇瓶转数180 r . min-1的恒温摇床中旋转振荡培养7d，获得双孢蘑菇W38液体菌种。

1.5.4 匀浆液体菌种的制备

在洁净工作台中，将双孢蘑菇液体菌种用组织捣碎机，刀轴在转数5000 r . min-1条件下捣碎1min，获得匀浆双孢蘑菇液体菌种。

1.6 分析方法

1.6.1 液体菌种活力测定

用接种针从液体菌种中挑取1粒菌丝球置于PDA平皿中央，每组10个平皿，重复3次，以麦粒原种为对照。接种后放入生化培养箱中25℃培养，观察菌丝萌发情况，记录萌发时间，培养5d后，在菌丝边缘画一起始线，继续培养10d，再在菌丝边缘画一终止线，测量菌丝生长长度，计算菌丝生长速度。

1.6.2 菌丝生长速度测定

当双孢蘑菇菌丝生长至1～2 cm时，在袋口端边缘画一起始线，待生长最快的菌丝即将长满菌种袋时再画一终止线，测量菌丝生长长度，计算菌丝生长速度。

1.6.3 液体菌种在固体培养基中的走菌实验

将500g麦粒基质基装入15cm×30cm折角聚丙烯菌种袋中，经126℃、2.5h高温高压灭菌，冷却后在超净工作台中接入10mL双孢蘑菇液体菌种，以麦粒菌种作为对照。接种后，置于培养室25℃培养，观察菌丝萌发、走菌情况，并计算栽培种成品率。

1.6.4 出菇试验

出菇试验的栽培方法参照文献[7]。

2 结果与分析

2.1 菌种活力的比较

将双孢蘑菇液体菌种和麦粒菌种转接PDA平皿中培养，对这2种类型的菌种活力进行比较，实验结果如表1 所示，液体菌种的菌丝萌发时间为36h，较麦粒菌种的24h长；它们在PDA平皿中发萌发率都为100%；液体菌种在PDA平皿的菌丝生长速度为4.35mm·d-1，较麦粒菌种的4.49mm·d-1慢，但两者的菌丝生长速度的差异不显著(P＜0.05)。

表1 液体菌种与麦粒菌种的活力比较

表2 液体菌种与固体菌种在麦粒培养基中的走菌情况

2.2 液体菌种在麦粒培养基中的走菌情况

向袋装麦粒培养基中接入10mL双孢蘑菇液体菌种，以麦粒菌种为对照，对应的菌种每组10袋，设3个重复，观察菌种在麦粒培养基中的走菌情况，测量菌丝生长长度，计算菌丝生长速度，记录满袋时间。由表2可知，液体菌种在麦粒培养基中的菌丝生长速度低于麦粒菌种，其中液体菌种的菌丝生长速度为3.51mm·d-1，麦粒菌种的菌丝生长速度3.53mm·d-1，但两者的差异不显著(P＞0.05)，这说明液体菌种在麦粒培养基的走菌速度与麦粒菌种相当。但液体菌种在麦粒培养基中的满袋时间短于麦粒菌种，两者的差异极其显著(P＜0.01)，这是由于液体菌种萌发点多且具有流动性所导致的。匀浆液体菌种没有在麦粒培养基中萌发，说明液体菌种经组织捣碎后得到匀浆液体菌种不适合在麦粒培养基中生长。

2.3 接种量的确立

在袋装麦粒基质中，不同的接种量对菌丝萌发的影响见表3，每个处理组20袋，重复3次，记录菌丝萌发情况，计算萌发率。由表3可知，随着接种量的增加，萌发率也逐步增大，当接种量达到10mL时，萌发率为100%。由此确定以液体菌种为种源的袋装栽培种（500g麦粒培养基）的接种量为10mL。

2.4 液体菌种为种源的栽培种成品率测定

以液体菌种作为原种，将10 mL双孢蘑菇液体菌种接入袋装麦粒培养基中，以麦粒菌种为对照组，每个处理组100袋，重复3次。在洁净工作台中分别将液体菌种和麦粒菌种接入麦粒培养基中，尔后置于培养架，在培养室25℃恒温培养，记录染菌情况，计算栽培种成品率。结果表明（表4所示），双孢蘑菇液体菌种接入麦粒培养基中，经培养，栽培种平均成品率能达到98%，优于麦粒菌种为种源的栽培种平均成品率96%，但两者的差异不显著(P＞0.05)。

表3 不同接种量对菌丝萌发的影响

表4 液体菌种与固体菌种制作栽培种成品率对比

2.5 接种方式的比较

在实验室条件下，液体菌种采用恒流泵和移液枪2种接种方式转接袋装麦粒培养基，以麦粒菌种采用传统的接种勺接种方式为对照，每组50袋，重复3次，记录接种所需时间，计算比较3种接种方式的接种效率。如表5所示，50袋菌袋采用恒流泵的接种方式所需接种时间为10 min，接种效率为300袋·h-1；采用移液枪的接种方式所需接种时间为12.5 min，接种效率为240袋·h-1；采用接种勺的接种方式所需接种时间为15min，接种效率为200袋·h-1。因此，采用恒流泵的接种方式所需接种时间最短，接种效率最高。

表5 不同接种方式的比较

2.6 液体菌种为种源的栽培种出菇表现

以液体菌种为种源的麦粒栽培种在培养料中萌发时间24h，与以麦粒菌种为种源的麦粒栽培种对照组相同，两者菌丝浓白，菌丝吃料、爬土时间都与对照组没有明显差异（见表6、图 1），但以液体菌种作为种源栽培种平均单产为14.52kg·m-2，略高于麦粒菌种为种源的麦粒栽培种平均单产14.49kg·m-2。但通过统计分析，它们的单产差异不显著(P＞0.05)。

表6 菌丝萌发吃料、爬土及出菇产量情况

3 讨论

从菌种活力比较试验结果中，我们可知液体菌种在PDA上的萌发时间比固体菌种长12 h，这可能由于菌种从液体转到固体培养，菌丝生长需要时间适应新的培养条件所造成的；它们具有相同的100%萌发率，菌丝生长速度差异不显著(P＞0.05)，说明它们的菌种活力相当。液体菌种在麦粒培养基中的菌丝生长速度低于固体菌种，但两者的差异不显著(P＞0.05)，但液体菌种在麦粒培养基中的袋时间短于固体菌种，两者的差异极其显著(P＜0.01)，这是由于液体菌种萌发点多且具有流动性所造成的。匀浆液体菌种没有在麦粒培养基中萌发生长，虽然菌丝球经匀浆后，萌发点增多，但直径较小的菌球或菌丝片段不适合在麦粒培养基中生长，这为今后的发酵罐的选型及液体菌种菌丝球大小要求提供参考依据。

在确立麦粒培养基接种量试验中，随着接种量的增大，会导致培养基含水量的增大，从而造成袋装底端的栽培种容易结块，播种时容易损伤菌种菌丝。因此，确立接种量为10mL较为适宜，含水量能控制在43%-45%范围内。在实验室条件下，液体菌种采用恒流泵接种方式转接袋装麦粒培养基所需接种时间最短，接种效率最高，是采用传统的接种勺接种效率1.5倍，因其具有流动性，可计量性，便于接种工艺的机械化、自动化应用。在出菇试验中，以液体菌种为原种扩繁的栽培种平均单产达14.52kg·m-2，与固体菌种为原种扩繁的栽培种单产差异不显著(P＞0.05)，这与韩文清等[6]得出试验结果类似。

研究采用的双孢蘑菇W38液体菌种是通过摇瓶发酵培养所获得的，还有待完善液体菌种发酵罐深层发酵培养工艺的技术参数。以液体菌种为原种扩繁栽培种，以固体菌种为对照，对双孢蘑菇液体菌种在栽培种生产中的应用做了初步研究，为证实液体菌种在双孢蘑菇制种工艺的应用具有优越性提供了科学依据。

[1] 戴建清，曾志恒.食用菌液体菌种研究现状及发展趋势[J]. 中国食用菌，2012，5: 1-3.

[2] WANG ZS. Progress on the breeding, spawn-making and year-round cultivation of Agaricus bisporus in Fujian, China[J].Acta Edulis Fungi, 2005, 12(Suppl. ): 236-242.

[3] 张鹏, 许占伍, 倪小军, 等. 金针菇工厂化生产液体菌种培养基的配方研究[J]. 食药用菌, 2012, 5: 296-297.

[4] 沈敏, 李文生, 周磊. 杏鲍菇液体菌种研制与工厂化栽培应用[J]. 中国农技推广, 2011, 27(6): 14-15.

[5] 黄爱荣，繆礼鸿，边银丙. 双孢蘑菇液体菌种发酵工艺研究[J]. 食用菌，2009（5）：12-13

[6] 韩文清，张锐，赵德胜. 双孢蘑菇液体菌种再固化应用研究[J]. 食用菌，2014（2）：40-41

[7] 王泽生，王波，卢政辉. 图说双孢蘑菇栽培关键技术[M]. 北京：中国农业出版社，2010:1-72.

S646

A

1007-550X（2016）09-0030-05

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.09.001

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项（2014R1020-3）、（2015R1020-2）；国家农业科技成果转化项目[闽财指（2014）969号]

2016-08-15

曾志恒(1984-)，男，硕士，主要从事食用菌制种工艺研究。

戴建清(1972-)，男，高级工程师，主要从事食用菌制种工艺研究（E-mail:djq1972@gmail.com）。