李晓丽　高　俊　樊　莹　郝娟娟　高　翔　宋美卿　张晋峰△



调经助孕胶囊对不孕大鼠卵巢FSHR、LHR的影响*

李晓丽1高俊2樊莹3郝娟娟4高翔1宋美卿5张晋峰5△

目的建立SD大鼠ASR模型，探讨调经助孕胶囊对排卵障碍性不孕模型大鼠性周期、卵巢组织形态、血清Inhibin-B(抑制素B)及卵巢FSHR(卵泡刺激素受体)、LHR(黄体生成素受体)的影响。方法给幼年雌性SD大鼠注射雄激素可导致其成年后不孕，这种雄激素致不孕的大鼠不排卵。结果调经助孕组大鼠阴道上皮细胞有明显的周期性变化；调经助孕组大鼠卵巢各级卵泡总数大于模型组(P<0.05)，调经助孕组大鼠卵巢病理性囊性卵泡个数小于模型组(P<0.05)；调经助孕组大鼠血清抑制素B含量高于模型组(P<0.05)；调经助孕组大鼠卵巢FSHR、LHR表达水平高于模型组(P<0.05)。结论调经助孕胶囊有使排卵障碍性不孕症的大鼠恢复性周期趋势的作用，增加模型大鼠血清Inhibin-B含量，提升卵巢储备功能，增强模型大鼠卵巢FSHR、LHR的表达水平，促进卵泡的发育与成熟。

调经助孕胶囊；排卵障碍性不孕；SD大鼠；FSHR；LHR；Inhibin-B

1　材料和方法

1.1实验动物及造模SD大鼠40只(动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2014-0004)。参照魏美娟、俞瑾等[1]方法，制作无排卵大鼠模型(ASR模型)。取40只第9日龄雌性SD大鼠于颈背部皮下注射丙酸睾丸酮注射液2.25mg/只(0.05ml/只)，第22日龄断奶，利用自然光照，室温维持在20℃左右，同样条件饲养，于山西省中医药研究院动物实验室由专人喂养。第70日龄大鼠体质量约150 g左右阴道开口, 连续阴道涂片2个性周期(1个性周期5天)，阴道上皮无性周期变化、呈持续性角化，提示无排卵大鼠模型制作成功。其病理机制可能是通过外源性雄激素影响肾上腺功能，进而干扰雌性大鼠早期分化中枢，继之使垂体卵泡刺激素、促黄体生成素分泌不足，最终影响卵泡发育及排卵[1，2]。

1.2分组随机将造模成功的30只大鼠分为模型组10只，调经助孕组10只，枸橼酸氯米芬组10只，同时设健康80日龄SD大鼠10只为正常组。

1.3给药方法从第80天开始分别按临床用药以60kg的人为标准, 按照体表面积剂量换算法计算大鼠给药剂量，每日给予10ml/kg灌胃。每天灌胃1次, 均连续灌胃28天。正常组每日给予蒸馏水灌胃；模型组每日给予蒸馏水灌胃；调经助孕组每日给予调经助孕胶囊溶液(浓度为0.15 g/ml)灌胃；枸橼酸氯米芬组每日给予枸橼酸氯米芬胶囊溶液(浓度为0.415mg/ml)灌胃。

1.4实验用药丙酸睾酮注射液(国药准字H31020524由上海通用药业股份有限公司生产)，调经助孕胶囊(批准文号：晋药制字AZ20080237由山西省中医药研究院制剂室生产)，枸橼酸氯米芬胶囊(国药准字：H44021870由广州康和药业有限公司生产)。

1.5检测指标

1.5.1大鼠阴道分泌物涂片观察连续给药28天后，于108天开始每天作阴道涂片1次，连续10天(两个性周期)。阴道分泌物采集：用消毒棉拭子旋转插入动物阴道内，然后在阴道内轻轻转动几下后取出，将带有阴道内含物的棉签在载玻片上均匀转动做成涂片，用95%酒精固定细胞，将涂片在空气中自然干燥。染色方法：苏木素4min，水2s，水2s，盐酸2s，水2s，水2s，氨水2s，伊红2min，75%酒精，85%酒精，95%酒精，无水乙醇10min，二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，晾干。于视频显微镜(中国医学科学院药物研究所出品)下观察涂片。

1.5.2血清中Inhibin-B含量测定给药28天后股动脉采血，4℃离心(3000r/min，10min)，取上清液，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测方法，试剂盒购自中国伊来瑞特公司，线性范围15.6～1000 pg/ml，显色终止后用美国Awareness公司生产的Start Fax-2100型自动生化分析仪，于波长450nm处读取吸光值，检测及操作步骤均严格按照说明书要求进行。

1.5.3显微镜下卵巢的观察采血后处死大鼠，取出卵巢组织，左侧卵巢放于4%多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水，透明、浸蜡、 包埋，石蜡切片，裱于载玻片上，于400倍光镜下观察,在 3个视野下，数各级卵泡和病理性囊性卵泡的个数，求平均值。

1.5.4卵巢组织中FSHR、LHR含量检测采用Westenblot法检测卵巢组织中FSHR、LHR的含量：将右侧卵巢组织，液氮研磨成粉末，称重，粉末放入2.5ml离心管中，加40ul裂解混合液(RIPA:PMSF=100:1)，冰浴30min；离心15min(1100rpm，4℃)；吸取上清液，-80 ℃保存备用。BCA法测定蛋白质浓度，通过计算，取各组等量蛋白质用于 SDS- PAGE 电泳，用10%～12%的梯度预制胶分离蛋白质，将凝胶上蛋白质经电转移到 PVDF 膜上，经过封闭、漂洗、一抗孵育、漂洗、二抗孵育和漂洗后加入新配制的ECL显色液显影、曝光。用凝胶成像系统分析软件定量蛋白质，所有数据均用内参Actin进行标准化处理。

2　结果

2.1各组大鼠阴道上皮细胞涂片观察调经助孕组大鼠阴道涂片有不同程度的周期性变化，连续两周期内(10 d)阴道涂片可见椭圆形扁平上皮细胞，白细胞和角化细胞的3种形态，较正常组周期有所延长,而模型组大鼠阴道涂片仍呈无周期性的角化细胞，枸橼酸氯米芬组3种细胞形态无规律。说明调经助孕胶囊有使排卵障碍性不孕大鼠恢复性周期趋势的作用。见表1。

表1　各组大鼠阴道细胞呈周期变化

2.2显微镜下卵巢的观察结果镜下可观察到模型组卵巢苍白，表面见卵泡，但卵泡多呈囊性扩张，大量闭锁卵泡和原始卵泡存在，无成熟卵泡，卵泡较小，无黄体，卵泡内含大量浆液性物质，卵泡壁颗粒细胞稀疏，层次明显减少。正常组和调经助孕组大鼠卵巢色泽鲜红，卵泡各级数目明显多于模型组，卵泡明显增大，表面见较多黄体。卵巢HE染色后，在400倍光镜下观察，在3个视野下，数各级卵泡和病理性囊性卵泡个数，求平均值，结果模型组卵泡数目明显少于正常组和调经助孕组，有显著差异(P<0.05)；模型组病理性囊性卵泡明显多于调经助孕组，有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠各级卵泡和病理性囊性卵泡个数比较　±s)

注：与模型组比较1)P<0.05

2.3各组大鼠血清中Inhibin-B含量大鼠血清中Inhibin-B含量的比较，正常组高于模型组(P<0.05)，调经助孕组与枸橼酸氯米芬组高于模型组(P<0.05)。现代研究认为抑制素B可作为预测卵巢储备力的直接指标[1]，调经助孕胶囊可以增加血清抑制素B含量。见表3。

组别样本数INHB(pg/ml)正常组10128.45±32.281)模型组1078.73±16.29调经助孕组10116.38±30.211)枸橼酸氯米芬组10103.03±22.191)

注：与模型组比较1)P<0.05

2.4各组大鼠卵巢FSHR、LHR蛋白水平表达大鼠卵巢FSHR蛋白水平的比较，正常组高于模型组(P<0.05)，调经助孕组与枸橼酸氯米芬组高于模型组(P<0.05)。大鼠卵巢LHR蛋白水平的比较，正常组高于模型组(P<0.05)，调经助孕组与枸橼酸氯米芬组高于模型组(P<0.05)。见表 4、图1。

组别样本数FSHRLHR正常组30.323±0.0261)0.318±0.0381)模型组30.102±0.0560.131±0.044调经助孕组30.369±0.0271)0.388±0.0201)枸橼酸氯米芬组30.254±0.0391)0.303±0.0421)

注：与对照组比较1)P<0.05

图1　鼠卵巢 FSHR、LHR Westernblot结果

3　讨论

不孕症是世界关注的人类自身生殖健康的问题，是女性最常见的妇科疾病之一，排卵障碍是导致不孕的主要原因之一，特别是在原发性不孕症中约占25%～30%。现代医学的临床、基础研究结果证实，卵泡发育及排卵主要是由“下丘脑-垂体-卵巢”性腺轴调控的，性腺轴的任何一个部位异常都可引起排卵障碍。

传统中医学认为排卵障碍性不孕症的根本病机在于肾虚，其中又夹杂着肝郁、血虚、痰湿等多种致病原因。肾主生殖功能的实现与调节天癸、冲任密切相关，也就是“肾-天癸-冲任-胞宫”, 这与现代医学的“下丘脑-垂体-卵巢轴”生理极为吻合。现代药理研究认为，补肾药能提高垂体对下丘脑的反应，改善内分泌调节功能；改善低雌激素环境，促进卵泡发育成熟。因而中医药治疗排卵障碍性不孕症多从补肾立法。基于此，我们选用补肾填精、养血调经之调经助孕胶囊对排卵障性不孕模型大鼠进行干预。对排卵障碍不孕患者，现代医学多选用枸橼酸氯米芬胶囊进行促排卵治疗，有明显的疗效，故本实验选择与其进行阳性对照。

本实验研究表明调经助孕胶囊可以增加血清抑制素B含量，提升卵巢储备功能；显著增加模型大鼠各级卵泡总数、减少病理性卵泡个数，重建性周期变化，并且通过增强卵巢FSHR、LHR的表达，促进卵泡的发育、成熟，有利于优势卵泡的形成，从而达到排卵的目的，治疗排卵障碍性不孕症。

[1]魏美娟，俞谨．补肾中药对雄激素致不孕大鼠肾上腺皮质形态学观察[J].中国中西医结合杂志，1994，14(12):736 -738.

[2]吕瑞莎，张建伟.妇科肾虚动物模型的研究进展[J].中医研究，2013，26(1)：72-75.

[3]魏俊英,傅金英.血清抑制素B对卵巢储备功能预测的研究[J].中医学报，2010，25(4):764-765.

[4]乐杰．妇产科学[M].8版．北京：人民卫生出版社，2012:381-384.

[5]罗元凯．实用中医妇科学[M].2版．上海：上海科学技术出版社，2010:278.

山西省自然基金项目(No.2013011053-8)

1.山西省中医药研究院硕士研究生2015级(太原 030012)；2.山西中医学院硕士研究生2015级(太原 030012)；3.山西省中医药研究院硕士研究生2014级(太原 030012)；4.山西中医学院硕士研究生2014级(太原 030012)；5.山西省中医院妇科(太原 030012)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.18.025

1003-8914(2016)-18-2662-03

(本文校对：李新玲2016-05-10)