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异养硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分离鉴定试验

2016-10-11李泳洪陈小岚许旭萍

绿色科技 2016年16期
关键词:硝态硝化生化

李泳洪,陈小岚,许旭萍

(福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108)



异养硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分离鉴定试验

李泳洪,陈小岚,许旭萍

(福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108)

采用异养硝化培养基与BTB培养基分离筛选到了一株异养硝化-好氧反硝化菌JB4,通过形态观察、生理生化鉴定及16SrDNA序列测定,初步鉴定JB4为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。试验结果表明:该菌株JB4具有良好的异养硝化-好氧反硝化能力,12h内氨氮去除率为76.95%~84.58%,亚硝态氮的积累量小于1.83 mg/L。

异养硝化;芽孢杆菌;脱氮

1 引言

笔者筛选到一株具备高效脱氮能力的异养硝化-好氧反硝化菌株,在此基础上,对其进行菌种鉴定、异养硝化性能的测定等,为进一步研究该菌株的脱氮路径、脱氮产物及其应用于实际废水的处理提供理论基础。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1样品

试验样品采自福州市闽侯县某排污口淤泥、闽江口某池塘废水及淤泥、建瓯福矛酒厂酒曲和堆积样等。

2.1.2培养基

(1)BTB培养基[5,6](g/L):丁二酸钠 4.72,NaNO30.85,KH2PO41.00;FeSO4·7H2O 0.20;MgSO4·7H2O 0.10,溴百里酚蓝1 mL,琼脂15(固体培养基加入),pH值=7.0~7.3。

(2)异养硝化培养基(HNM)(g/L):(NH4)2SO40.24,丁二酸钠2.17,维氏盐溶液50mL,琼脂20(固体培养基加入),pH值=7.0。

(3)维氏盐溶液(g/L):K2HPO4·3H2O 6.50,MgSO4·7H2O 2.50,NaCl 2.50,FeSO4·7H2O 0.05,MnSO4·H2O 0.04 。

(4)好氧反硝化培养基(DM)(g/L):把异养硝化培养基中的氮源改成KNO30.72,其它同异养硝化培养基,pH值=7.0。

(5)LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 5,葡萄糖2,琼脂20(固体培养基加入),pH值=7.0~7.2。

2.2异养硝化-好氧反硝化细菌的分离筛选

分离纯化菌株主要运用梯度稀释平板法和平板划线法[7]。将样品稀释液涂布于异养硝化固体培养基上培养,待长出单菌落,挑取不同形态菌落进行多次划线分离后得到纯菌株,将其接种到斜面培养基中保存并编号。结合格林斯试剂法[8]和BTB法[9],对分离得到的菌株进行异养硝化活性和好氧反硝化活性的鉴别,初步判断筛选的菌株是否为异养硝化-好氧反硝化菌。将初筛得到的菌株接种于异养硝化液体培养基中进行培养,测定氨氮的含量并计算脱氮率,选取脱氮效果较好的菌株作为实验菌株进行后续研究。

2.3菌株的鉴定

2.3.1形态学鉴定

将待鉴定的菌株接种到LB培养基平板上,28 ℃培养48h后观察菌落特征;并挑取少量菌体制片进行革兰氏染色和芽孢染色,然后光镜观察菌体形态;同时,用JSM-6500F扫描电子显微镜观察菌体形态并摄像。

2.3.1生理生化鉴定

菌株的生理生化特性采用细菌自动鉴定系统进行测定。

2.3.216SrDNA序列测定与系统发育分析

16SrDNA测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。将所得序列信息提交GenBank数据库BLAST比对后,选择同源性较高的相关序列,由Clustal X序列比对软件进行多序列匹配,然后由Mega 4.0构建菌株JB4的16SrDNA系统进化树。

2.4生长及脱氮曲线

2.5分析方法

硝态氮的测定采用麝香草酚分光光度法[10];氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法;亚硝态氮的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[11];菌体生长量测定采用浊度法(OD600)。

3 结果和分析

3.1异养硝化-好氧反硝化菌株的分离与鉴定

经多次分离纯化,筛选得到一株具有较高脱氮能力的异养硝化-好氧反硝化菌株,命名为JB4。

3.1.1形态学鉴定

菌株JB4在LB培养基平板上28 ℃培养48 h后呈现的菌落特征为:圆形,白色,表面褶皱,有光泽,边缘呈波状,不透明。菌落直径为0.3~0.8 cm。菌株JB4革兰氏染色阳性,细胞呈直杆状、有芽孢,菌体大小为(0.57~0.95) μm×(1.71~3.8) μm,如图1所示。

图1 菌株JB4扫描电子显微镜图片(×8000)

3.1.2生理生化特性

菌株JB4的生理生化特性为:兼性厌氧;可以在含有海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、葡萄糖、D-核糖培养基上生长并产酸,不能在含有D-棉子糖、D-麦芽糖、乳糖、D-山梨醇、D-木糖培养基上生长并产酸;精氨酸双水解酶1阳性,精氨酸双水解酶2阴性;L-乳酸盐产碱阳性;酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶阳性。该菌株能在盐度为6.5%的培养液中生长。

3.1.316SrDNA序列测定与系统发育分析

提取并测定片段长度为1417bp的16SrDNA序列。此序列在NCBI数据库中进行同源性比较,结果显示菌株JB4和多株Bacillus sp.16SrDNA的相似性达99%以上,结合菌株的形态特征和生理生化特性,初步鉴定其为Bacillus sp.。选取同源性较高的序列用Mega 4.0软件,以Neighbor-joining法绘制系统进化树。

3.2JB4生长曲线及脱氮性能

菌株JB4在初始硝态氮浓度为442 mg/L的好氧反硝化培养基中的生长曲线如图2(B)所示。由OD600变化可知,菌株JB4在0~4 h是延迟期, 4~12 h为对数期,16 h后OD600达到最大值0.642,20 h降至0.546,之后保持稳定,基本与在异养硝化培养基中的生长规律一致。由硝态氮的质量浓度变化可知,菌株JB4培养4h后的硝态氮由442 mg/L降至70.30 mg/L,脱氮率达到84.09%,12h后降到最低61.58 mg/L,脱氮率达到86.07%。反硝化过程的第一步是还原成亚硝态氮,然后再转变成N2O和N2。由刘俊女的研究[12]可知,亚硝态氮的累积与脱氮中间产物N2O的生成有正相关关系,而该实验中的亚硝态氮的累积量很小,最高也不超过1.83 mg/L,可以推测脱氮过程中N2是最主要的最终脱氮产物。与已报道的相关菌株X3和XF3相比[4,6](菌株X3经12h培养,硝态氮浓度从初始42 mg/L降到29.80 mg/L,去除率为29.05%,培养18h时硝态氮降至12.32 mg/L,去除率为70.67%;菌株XF3经48 h培养,硝态氮浓度可从初始84 mg/L降到9 mg/L,脱氮率高达89.3%,但是亚硝态氮积累量达到11.22 mg/L),菌株JB4硝态氮去除速率更高。此结果说明菌株JB4具备高效的好氧反硝化能力,且反硝化作用主要发生在菌株生长的对数期。

图2菌株JB4在异养硝化(A)和好氧反硝化培养基(B)中的生长降解曲线

4 结论

(1)从福矛酒厂的堆积样中分离到一株异养硝化-好氧反硝化细菌JB4。JB4生长迅速、脱氮效果高,亚硝态氮积累量低于1.83 mg/L。

(2)经形态观察、生理生化特性鉴定及16SrDNA序列分析,将JB4鉴定为芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。

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2016-07-04

福建省自然科学基金项目(编号:2013J01123)

李泳洪(1994—),男,福建师范大学生命科学学院学生。

许旭萍(1962—),女,教授,主要从事废水微生物处理技术研究。

X832

A

1674-9944(2016)16-0023-03

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