薛　山

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州　363000)



柑橘皮渣中非水溶性抗氧化膳食纤维提取工艺优化

薛山

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州363000)

用酶法提取榨汁后剩余柑橘皮渣中的非水溶性抗氧化膳食纤维(IADF)，并以提取物对DPPH自由基的清除能力作为抗氧化指标进行单因素和响应曲面优化试验。结果表明：在料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用温度67 ℃，糖化酶作用温度64 ℃条件下，所提取的IADF抗氧化效果最显著，为3.520 mmol Trolox /100 g IADF。

柑橘；皮渣；非水溶性膳食纤维；抗氧化

柑橘是世界第一大、中国第二大水果。在柑橘加工过程会生成40%～50%的皮渣副产物，其中橘皮(黄皮层和白皮层)几乎为全果的25%[1]。膳食纤维(dietary fiber，DF)凭借其特殊的结构组成和生理功效得到了学术界的广泛关注。作为人体必不可少的“第七营养素”，膳食纤维因其丰富而独特的性质备受关注[2]。然而，尽管诸多学者有研究果蔬(柑橘)[3-4]以及粮食谷物[5-6]中的膳食纤维提取，但是均以提取率为最终的指标，而忽略了膳食纤维中多酚物质所赋予其的抗氧化性。据报道[7-8]，柑橘果皮中的膳食纤维中含有丰富的生物活性物质，主要包括酚酸和黄酮类化合物等自然抗氧化物质。

1998年，Saura-Calixto[9]基于此提出了一个新概念——抗氧化膳食纤维(antioxidant dietary fiber，ADF)，即大量天然抗氧化剂结合到DF基质中的产物。ADF按水中溶解性的不同分为水溶性膳食纤维(soluble antioxidant dietary fiber，SADF)和非水溶性膳食纤维(insoluble antioxidant dietary fiber，IADF)，其中IADF中富含黄酮类(花色素苷、黄烷、黄酮、黄酮醇、黄烷醇)、酚酸(没食子酸、阿魏酸)以及缩合单宁(聚合的原花色素和高分子量水解鞣质)等天然抗氧化成分[10-12]。目前，植物性膳食纤维已被证实具有显著的抗氧化活性[13]，并且已广泛应用于食品保鲜与功能食品研发等领域[14-15]。国外对于抗氧化膳食纤维的研究多集中于葡萄皮渣[10]和芒果皮渣[16]的应用研究，而有关柑橘皮渣中ADF的报道较少。从国内的研究情况来看，已有学者探讨了植物性食品中膳食纤维的抗氧化活性[14]，但ADF这一概念仅在谌小立等[13]综述中有提出，而针对柑橘皮渣中IADF的研究暂未查阅到。此外，关于IADF的提取，国内外学者多以提取率为指标，而本试验以IADF的抗氧化性为基准，对IADF的提取方法进行优化，具有一定的创新性。本研究拟从ADF角度出发，以DPPH清除率为指标初步确定IADF的提取工艺，并通过单因素试验和响应曲面试验优化提取工艺，以期为日后柑橘皮渣中IADF的成分测定、提取利用及功能研究提供依据和参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

柑橘皮渣：重庆市柑橘研究所；

α-淀粉酶(中温)：酶活1 500 U/g，北京奥博生物技术有限公司；

酸性蛋白酶和糖化酶：酶活分别为3万U/g和10万U/g，上海博蕴生物科技有限公司；

1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析纯，美国Sigma公司；

甲醇、HCl、丙酮、无水乙醇、Na2CO3、NaOH、Na2HPO4和NaH2PO4：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2主要仪器设备

数显恒温磁力搅拌器：85-2型，金坛市易晨仪器制造有限公司；

台式离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；

循环水式多用真空泵：SHB-III型，郑州长城科工贸有限公司；

鼓风烘箱：DHG-9240A型，上海一恒科技有限公司；

可见分光光度计：722型，上海现科分光仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：HWS-26型，上海齐欣科学仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-5298型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1柑橘皮渣预处理将柑橘皮渣切碎(1 cm×1 cm)，80 ℃烫漂30 s，离心脱水后，于65 ℃鼓风烘箱内干燥48 h。干燥后的皮渣用粉碎机粉碎，过60目筛，密封于塑料袋中，置于阴凉干燥处备用。

1.2.2柑橘皮渣化学组成的测定

(1) 水分：参照文献[17]。

(2) 总灰分：参照文献[18]1-2。

(3) 脂类：参照文献[18]43-46。

(4) 粗蛋白：参照文献[18]34-42。

(5) 可溶性糖：参照文献[19]。

(6) 可提多酚：根据Sánchez-Alonso等[10]方法，修改如下：样品液的制备：称取1.000 0 g柑橘皮渣粉(干重)，加入40 mL甲醇/水(体积比1∶1)，用HCl(3 mol/L)调pH至2.0。将混合体系在室温搅拌1 h，之后以2 500×g离心10 min，收集上清液。向所得残渣中加入40 mL丙酮/水(体积比7∶3)，在室温下振荡1 h，再以2 500×g离心10 min，重复两次操作。将所得上清液合并，于50 ℃旋转蒸发，冷冻干燥后溶解于10 mL无水乙醇。

多酚的测定：取样品液0.1 mL，加入2 mL蒸馏水和1 mL Folin-Ciocalteu试剂(稀释10倍)，室温静置6 min后，向混合体系中加入0.9 mL 75 mg/mL的Na2CO3溶液，定容至10 mL。混合体系静置2 h后，于波长750 nm处测定吸光值，用蒸馏水作为空白对照。总多酚的量用没食子酸当量(GAE，mg/g·干重)来表示。

(7) 水溶性膳食纤维：参照AOAC法[20]。

(8) 非水溶性抗氧化膳食纤维的制备：参照Hassan等[20]方法，修改如下：称取脱脂的干燥样1.000 0 g，溶于50 mL pH 6.0(0.2 mol/L)的PBS中，加入0.2 mL的α-淀粉酶溶液(50 mgα-淀粉酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS中)，盖上铝箔，于60 ℃磁力搅拌15 min，然后从水浴中移出，冷却到室温。用0.325 mol/L的盐酸调节混合体系pH至2.0～3.0，加入0.2 mL的蛋白酶溶液(50 mg蛋白酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS中)，盖上铝箔，于38 ℃磁力搅拌0.5 h，去除样品中的蛋白质。待样品冷却至室温，用0.275 mol/L的NaOH(约10 mL)将上述溶液pH调节至4.0～4.5，加入0.3 mL/g糖化酶溶液1 mL，60 ℃水浴30 min，将所得的混合体系过滤，过滤后所得的残渣分别用蒸馏水、丙酮洗涤，于105 ℃烘至恒重即可(最终的结果应当用样品中残留的不能消化的蛋白质的含量和灰分的含量进行校正，总膳食纤维是消化后的残留物的质量减去不能消化的蛋白质和灰分质量的差值)。

1.2.3单因素试验

(1)α-淀粉酶作用时间：考察α-淀粉酶作用时间分别为5，10，15，20，25 min时，对IADF抗氧化性的影响。其他反应条件为：料液比50∶1(mL/g)，α-淀粉酶溶液用量0.1 mL/g·皮渣，α-淀粉酶作用温度60 ℃，用HCl调节pH至2.0～3.0，蛋白酶溶液用量0.1 mL/g·皮渣，38 ℃水浴30 min，NaOH调节溶液pH至4.2～4.6，糖化酶溶液0.3 mL/g，60 ℃水浴30 min。

(2) 蛋白酶作用时间：考察38 ℃蛋白酶作用时间分别为5，10，15，20，25 min时，对IADF抗氧化性的影响。α-淀粉酶作用时间为15 min，其他反应条件同1.2.3(1)。

(3) 糖化酶作用时间：考察60 ℃糖化酶作用时间分别5，10，15，20，25 min时，对IADF抗氧化性的影响。蛋白酶用作用时间为10 min，其他反应条件同1.2.3(2)。

(4)α-淀粉酶溶液用量：考察α-淀粉酶溶液用量分别为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣时，对IADF抗氧化性的影响。糖化酶作用时间为10 min，其他反应条件同1.2.3(3)。

(5) 酸性蛋白酶溶液用量：考察蛋白酶溶液用量分别为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣时，对IADF抗氧化性的影响。α-淀粉酶溶液用量为0.1 mL/g·皮渣，其他反应条件同1.2.3(4)。

(6) 糖化酶用量：考察糖化酶溶液用量分别为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣时，对IADF抗氧化性的影响。酸性蛋白酶溶液用量为0.20 mL/g·皮渣，其他反应条件同1.2.3(5)。

(7) 料液比：考察料液比分别为30∶1，35∶1，40∶1，45∶1，50∶1(mL/g)时，对IADF抗氧化性的影响。糖化酶溶液用量为0.15 mL/g·皮渣，其他反应条件同1.2.3(6)。

(8)α-淀粉酶作用温度：考察α-淀粉酶作用温度分别为50，55，60，65，70 ℃时，对IADF抗氧化性的影响。其他反应条件同1.2.3(7)，料液比为35∶1(mL/g)。

(9) 糖化酶作用温度：考察糖化酶作用温度分别为50，55，60，65，70 ℃时，对IADF抗氧化性的影响。α-淀粉酶作用温度为65 ℃，其他反应条件同1.2.3(8)。

1.2.4试验优化设计采用中心组合试验设计(central composite design，CCD)原理，结合单因素试验结果，以抗氧化性为响应值，对α-淀粉酶溶液用量、α-淀粉酶作用时间、蛋白酶作用时间、糖化酶溶液用量和糖化酶作用时间进行优化。在α-淀粉酶用量(0.1 mL/g·皮渣)与作用时间(15 min)、蛋白酶作用时间(10 min)、糖化酶用量(0.15 mL/g·皮渣)与作用时间(10 min)固定条件下，考察料液比、酸性蛋白酶用量、淀粉酶作用温度、糖化酶作用温度对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.5非水溶性抗氧化膳食纤维对DPPH·的清除能力

采用以下基于固体粉末抗氧化测定的方法对IADF中结合态多酚的抗氧化性进行评价。试验均以溶于乙醇的Trolox溶液作为标准物绘制标准曲线。样品抗氧化能力用Trolox等价抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)表示，即Trolox μmol/g IADF(干重)，乙醇作为空白对照。

测定方法根据Serpen等[21]报道，修改如下：取10 mg IADF，加入1.7 mL DPPH·试剂以进行反应[0.024 mg/mL的DPPH乙醇(95%)溶液]。测定操作以DPPH·的加入为起始，待混合物反应0，15，25 min时分别振荡3 min，使得样品与DPPH试剂充分反应。将该混合物以9 200×g离心2 min，收集上清液于734 nm处比色，测定吸光值。测定总时间准确控制为30 min。

1.2.6数据处理用SPSS16.0和Design Expert 7.1 进行数据分析。方差分析(P<0.05为显著差异)，用Turkey’s HSD进行分析，数据以平均值±标准偏差表示。

2　结果与讨论

2.1柑橘皮渣中的化学成分

由表1可知，柑橘皮渣中总可提取酚含量有(2.56±0.03)%，可溶性糖含量约占35%，基本与前人结果一致。膳食纤维含量近80%，其中可溶性膳食纤维略高于王菁等[22]的研究结果，可能是此次试验材料不是纯的柑橘皮，还包括榨汁后的瓤肉。

表1　柑橘皮渣中的化学成分

2.2优化试验结果

根据单因素试验结果，按照中心组合试验设计，设定不同料液比、蛋白酶加入量、淀粉酶作用温度以及糖化酶作用温度(见表2)，进行四因素五水平的优化试验，结果见表3。对表3数据进行多元回归拟合，获得抗氧化性(Y)的二次多项回归方程为：

(1)

表2　中心组合设计因素水平表

表3　抗氧化性的中心组合试验方案与结果

由图1(a)可知，在料液比小于35.7∶1(mL/g)时，随着料液比的增加，产品抗氧化性IADF的抗氧化性增加。当料液比大于35.7∶1(mL/g)以后，抗氧化性随着其用量增加有降低的趋势。同时，随着蛋白酶量的增加，更有利于IADF的提取，但当酶加入过多时(>0.21 mL/g·皮渣)，抗氧化性出现下降的趋势。

由图1(b)可知，当料液比一定时，淀粉酶作用温度的升高能够促进所提IADF的抗氧化性；当淀粉酶作用温度一定时，随着料液比的增加，所提IADF的抗氧化性明显增高。在料液比34.68∶1(mL/g)，淀粉酶作用温度达66.6 ℃时，IADF的DPPH·清除率出现最大值。

由图1(c)可知，当料液比一定时，随着糖化酶作用温度的升高，所提IADF的抗氧化性呈上升趋势；但温度过高后，可能会导致DF中的抗氧化物质如酚类被溶出，或者所提IADF中的结合酚被破坏。

图1　料液比、蛋白酶用量、淀粉酶作用温度、糖化酶作用温度交互响应面图

方差来源平方和自由度均方F值P值模型23.81141.707.700.0002**X11.2011.205.410.0345*X21.3611.366.150.0255*X32.7812.7812.580.0029**X40.09110.0910.410.5299X1X20.3310.331.500.2400X1X32.2812.2810.340.0058**X1X40.6010.602.720.1198X2X30.09610.0960.430.5200X2X40.2110.210.930.3494X3X43.6713.6716.620.0010**X211.6711.677.560.0149*X222.0312.039.210.0084**X231.7211.727.770.0138*X249.1419.1441.38<0.0001**残差3.31150.22失拟2.97100.303.610.0596纯误差0.3450.069总变异27.1229

†**为差异极显著(P<0.01)；*为差异显著(P<0.05)。

由图1(d)可知，当淀粉酶作用温度控制在66.5 ℃以下时，提高蛋白酶加入量，IADF的抗氧化性有上升的趋势，当蛋白酶用量过高，会阻碍所提IADF抗氧化性的发挥。

由图1(e)可知，当蛋白酶加入量一定时，随着糖化酶作用温度的增加，能够有效地提取IADF，并且很可能对其结合的酚类等抗氧化物质起到活化作用。

由图1(f)可知，淀粉酶作用温度一定时，随着糖化酶作用温度的升高，IADF的抗氧化性上升。当淀粉酶的作用温度约在67 ℃，糖化酶作用温度约在64 ℃时，IADF的DPPH清除率出现最大值。

利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化，得优化条件为：料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用温度67 ℃，糖化酶作用温度64 ℃。对此优化结果进行验证实验，测得产品抗氧化性为3.520 mmol Trolox/100 g IADF，与预测值(3.556 mmol Trolox/100 g IADF)基本一致，再次验证了回归方程的正确性(相对误差1%)。

ADF的抗氧化性主要依赖于其中所含的多酚类物质，这些多酚物质分为可提取多酚(EPP)和不可提取多酚(NEPP)，其中EPP较易提取，且具有很强的抗氧化活性[10]，而NEPP一般与膳食纤维、细胞壁、蛋白质结合紧密，难溶于有机溶剂和水。多数学者[7,23]将抗氧化膳食纤维的抗氧化功能归结于其中的EPP，但也有学者[12]通过研究其中的NEPP发现，NEPP 猝灭过氧化自由基方面比单体酚有效15～30倍。目前来讲，文献对EPP和NEPP活性的报道不完全一致，推测其原因可能是与其中所含酚类的种类和含量有关。

3　结论

酶法能够有效提取柑橘皮渣中的IADF。优化试验表明料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用温度67 ℃，糖化酶作用温度64 ℃条件下，所提取的IADF抗氧化效果最显著，为3.520 mmol Trolox /100 g IADF。该研究从“ADF”这一概念出发，以IADF的抗氧化性为指标进行工艺优化，此内容尚未见有报道。因此，本课题的研究将为包括柑橘皮渣在内的植物性食品中IADF及其产品的研发、应用与推广提供理论参考和创新依据。除此之外，由于柑橘皮渣中IADF抗氧化活性可能与其中所含的酚类以及吸附螯合有机物的理化特性相关，具体的作用机理也将是日后进一步研究的方向。

[1] 付复华, 李忠海, 单杨, 等. 柑橘皮渣综合利用技术研究进展[J]. 食品与机械, 2009, 25(5): 178-184.

[2] 赵二劳, 王璐. 膳食纤维的保健功能及其制备研究进展[J]. 食品与机械, 2011, 27(3): 165-168.

[3] 曾祥燕, 赵良忠. 桔子皮渣水溶性膳食纤维提取工艺的优化[J]. 食品与机械, 2012, 28(1): 193-196.

[4] 彭娅, 彭荣, 殷钟意, 等. 柑橘皮渣水溶性膳食纤维的柠檬酸提取工艺优化[J]. 食品工业科技, 2015, 36(2): 243-247.

[5] 杜振亚, 陈复生, 布冠好. 小麦麸皮及其保健功能研究进展[J]. 食品与机械, 2015, 31(1): 253-256.

[6] 张根生, 葛英亮, 聂志强, 等. 马铃薯渣不溶性膳食纤维超微粉碎改性工艺优化[J]. 食品与机械, 2015, 31(6): 186-189.

[7] CHAU C, HUANG Y. Comparison of the chemical composition and physicochemical properties of different fibre prepared from de peel of Citrus sinensis L. cv. Liucheng[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003, 51(9): 2 615-2 618.

[8] FIGUEROLA F, HURTADO M, ESTEVEZ A, et al. Fiber concentrates from apple pomace and citrus peel as potential fibre sources for food enrichment[J]. Food Chemistry, 2005, 91(3): 395-401.[9] 薛菲, 陈燕. 膳食纤维与人类健康的研究进展[J]. 中国食品添加剂, 2014(2): 208-213.

[11] SANCHEZ-ALONSO I, BORDERIAS A J, LARSSON K, et al. Inhibition of hemoglobin-mediated oxidation of regular and lipid-forti-fied washed cod mince by a white grape dietary fiber[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(13): 5 299-5 305.

[13] 谌小立, 赵国华. 抗氧化膳食纤维研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(5): 291-294.

[14] 周小理, 钱韻芳, 周一鸣. 植物性膳食纤维抗氧化活性的研究与应用[J]. 食品与机械, 2010, 26(3): 158-160.

[15] 王思远, 刘学铭, 陈智毅, 等. 富含膳食纤维的柚皮粉制备及其特性研究[J]. 现代食品科技, 2014, 30(11): 170-174.

[16] VERGARA V N, GRANADOS P E, AGAMA A E, et al.fibre concentrate from mango fruit: characterization, associated antioxidant capacity and application as a bakery product ingredient[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40(4): 722-729.[17] Association of Official Analytical Chemists. AOAC, Official Methods of Analysis, 18th ed[S]. USA, Gaithersburg: [s. n.], 2005.[18] 全国文献工作标准化委员会第七分委会. GB/T 5009—2010食品安全国家标准汇编[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[19] LIOBERA A, CANELLAS J. Dietary fibre content and antioxidant activity of manto negro red grape (vitis vinifera ): pomace and stem[J]. Food Chemistry, 2007, 101(2): 659-666.

[20] HASSAN F A, ISMAIL A, HAMID A A, et al. Characterisation of fibre-rich powder and antioxidant capacity of Mangifera pajang K. fruit peels[J]. Food Chemistry, 2011, 126(1): 283-288.[21] SERPEN A, CAPUANO E, FOGLIANO V, et al. A new procedure to measure the antioxidant activity of insoluble food components[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(19): 7 676-7 681.

[22] 王菁, 蒲彪, 伍红梅. 柑橘果皮中主要功能性成分含量测定[J]. 食品工业科技, 2010, 31(3): 367-369.

[23] PÉREZ-JIMÉNEZ J, SERRANO J, TABERNEROM, et a1. Effects of grape antioxidant dietary fiber in cardiovascular disease risk factors[J]. Nutrition, 2008, 24(7/8): 646-653.

The optimization of extraction process of insoluble antioxidant dietary fiber from orange pomace

XUE Shan

(College of Biological Science and Technology, Minnan normal university, Zhangzhou, Fujian 363000, China)

The enzymes-chemical method was used to extract the insoluble antioxidant dietary fiber (IADF) from the remaining orange pomace after oppressing juice. The single factor experiment and response surface optimization have carried out considering the clearance rate of DPPH free radical as the indicator. The results of response surface showed that the clearance rate of free radicals was best in the condition of liquid ratio 33.58 mL/g, protease dosage of 0.21 mL/g, amylase temperature of 67 ℃ and glucoamylase temperature of 64 ℃, and highest value was up to 3.520 mmol Trolox/100 g IADF.Key words: orange; pomace; insoluble dietary fiber; antioxidant

2015年福建省科协科技思想库研究项目(决策咨询类)重点项目(编号：FJKX-A1520)；闽南师范大学博士科研启动基金(编号：2006L21513)

薛山(1988—)，女，闽南师范大学讲师，博士。

E-mail: yixunchenglion@sina.com

2015—12—30

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.037