王建辉 王　秀 王发祥 李向红 俞　健 靳　娜 刘永乐

(长沙理工大学湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙　410114)



冷藏条件下带蓬鲜莲优势腐败菌鉴定及其消长规律研究

王建辉 王秀 王发祥 李向红 俞健 靳娜 刘永乐

(长沙理工大学湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙410114)

通过稀释平板法分离4 ℃条件贮藏18 d的带蓬鲜莲腐败菌，提取筛选菌株DNA后进行PCR扩增，采用细菌16S rDNA菌种鉴定法对优势腐败菌进行鉴定，并分析其4 ℃冷藏过程中的消长规律。结果表明，带蓬鲜莲4 ℃冷藏过程中的优势腐败菌主要为分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)。且4 ℃贮藏期间，分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的变化趋势大体相同，适应期后呈增长趋势，成团泛菌变化规律不明显。

鲜莲；冷藏；优势腐败菌；分离鉴定；消长规律

鲜莲营养丰富，味道鲜美，口感甜脆[1]，具有益心、补肾、健脾、止泻和安神等多重功效[2-4]，但常温下易软化皱缩，货架期3～6 d，采后低温4 ℃带蓬贮藏也仅能维持15 d[5]。鲜莲在采摘、运输、加工及贮藏过程中极易腐败变质，丧失其原有的鲜食风味，直接影响其感官品质及食用价值，极大限制了鲜食莲子的销售和消费者的需求。研究[6]表明，微生物活动是引起果蔬腐败变质的主要原因之一，果蔬常见腐败菌有：沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonasspp)、李斯特菌(Listeria)、黄单胞菌(Xanthomonas)等[7]，对莲子危害最大的微生物主要是曲霉属和青霉属霉菌[8]。目前国内外鲜莲研究处于起步阶段，有关鲜莲优势腐败菌分离鉴定研究尚无报道。随着分子生物学的快速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类深入到各种基因型分类水平，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、16S rRNA 序列分析等技术[9-10]。16S rDNA 序列分析技术在一定程度上克服了传统表型、生理生化指标鉴定微生物的局限性，能简便、快速准确地鉴定微生物[11-12]。

本研究以带蓬鲜莲为研究对象，通过16S rDNA 序列分析技术初步鉴定低温贮藏下带蓬鲜莲的主要优势腐败菌，并分析其优势菌的消长变化规律，对进一步监控和靶向抑制鲜莲品质变化以及鲜莲低温贮藏新技术的开发，提高其贮藏品质，延长货架期均具有很好的理论价值。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜莲蓬：由湖南省湘潭县湘莲种植基地提供；

PCA培养基、营养琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司；

Folin酚试剂、NaCl、异戊醇：分析纯，国药集团化学有限公司；

琼脂糖：电泳级，生工生物工程上海股份有限公司；

Tris-乙酸-EDTA：电泳级，北京索莱宝生物科技有限公司；

溴化乙锭(EB)、PCR试剂等：电泳级，美国sigma公司。

1.2仪器与设备

电子分析天平：AUY120型，日本岛津公司；

立式压力蒸汽灭菌器：DY01-13-44-00型，上海东亚力容器制造有限公司；

超声波清洗器：KQ-500B型，昆山市超声仪器有限责任公司；

摇床：ZHWY-100C型，上海智城公司；

生化培养箱：DZX180型，上海艾测电子科技有限公司；

显微镜：BH-2型，日本Olympus公司；

PCR仪：T100型，美国Thermo公司。

1.3方法

1.3.1鲜莲原料处理新鲜莲蓬在低温条件下快速运回实验室。选取成熟度一致、大小均匀、无病虫害和机械损伤的带蓬鲜莲样品于RH(相对湿度)65%～70%，温度4 ℃恒温条件下贮藏。

1.3.2优势菌落的确定根据王建辉等[5]的研究，带蓬鲜莲货架期为15 d，18 d时莲蓬表面菌斑明显增多，质地明显变软，感官品质明显下降。故取贮藏18 d的带蓬鲜莲样品，在超净环境下，于无菌的组织捣碎机中捣碎，准确称取捣碎后的莲肉样品10.00 g于250 mL无菌的锥形瓶中，注入90 mL无菌生理盐水，振荡30 min。然后取1 mL进行10倍梯度稀释，在预试验的基础上，选择3个适合的稀释度倾注平板，平行3份，36 ℃培养48 h后进行菌落计数。并通过肉眼观察，记录各个稀释度的菌落特征，并将数量最多的4～5种菌落视为优势菌。

1.3.3优势菌的分离纯化挑选1.3.2中各优势菌于PCA平板上进行多次划线分离，得到单菌落后继续传代培养，对各代的单菌落进行革兰氏染色，显微镜观察细胞形态、大小等，直至尽可能得到纯的单菌落，将纯化好的菌株保存于营养琼脂斜面试管，并于4 ℃低温保存备用。

1.3.4优势腐败菌的鉴定

(1) 形态观察：将经1.3.3纯化后菌株接种于平板上，36 ℃下培养48 h，期间结合肉眼与革兰氏染色后显微镜观察各优势菌的菌落特征、细胞形态[13-14]以及相对比例等。

(2) 细菌16S rDNA菌种鉴定：经纯化的菌株采用细菌16S rDNA 菌种鉴定方法进行鉴定[15]。将纯化的5 种优势腐败菌接种于10 mL LB 培养基中，37 ℃振荡过夜培养，分别提取1#～5#腐败细菌的基因组DNA，以通用引物：16S(F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S(R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

PCR扩增其16S rDNA，回收1 500 bp 长度左右的PCR 产物，送至上海生工股份有限公司进行DNA测序，将测定的序列通过Blast 程序与GenBank 数据库中已有的16S rDNA序列进行相似性比较分析，根据16S rDNA序列相似性构建系统发育树，判定细菌种类。

1.3.5鲜莲贮藏过程中腐败菌的生长规律参考Chang Shu-chen等[16]的方法，并稍做修改。将于4 ℃冷藏条件下0～24 d的鲜莲每3 d取样，在无菌条件下进行稀释平板计数，分别统计各优势腐败菌个数，并绘制其生长规律曲线。

2　结果与分析

2.1腐败菌的分离和优势腐败菌的确定

通过倾注平板、培养、观察、计数，根据菌落形态特征将所有菌落大致分为8组，分别编号为1#～8#，将数量最多5种菌视为优势腐败菌，鲜莲低温贮藏条件下5种优势腐败菌菌落形态及相对比例见表1。

表1　优势腐败菌形态及组成

2.2优势腐败菌的鉴定

2.2.1优势腐败菌16S rDNA的扩增结果分别提取腐败菌1#～5#号的基因组DNA，进行PCR扩增，扩增出的PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。由图1可知，1#～5#号腐败细菌基因经PCR扩增后，扩增产物经电泳分离获得比较清晰的条带，可见PCR扩增产物主要位于1 500 bp左右，且获得的目的基因经凝胶电泳可很好地纯化分离。

2.2.2优势腐败菌16S rDNA 鉴定结果通过细菌16S rDNA可变区的差异对菌种类别进行区分。回收2.2.1中的目的基因片段，并送至上海生工股份有限公司测序，将测序获得的1#～5#腐败菌的16S rDNA 序列与NCBI数据库中已有的序列进行Blast相似检索，从Genbank核苷酸数据库中挑选同源性较高的16S rDNA序列进行比较，利用MAGE 5软件构建系统发育树[17]，结果见图2。1#(L1)、2#(L2)菌株分别与分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)亲缘关系最近，验证可信度达99%；3#(L3)和5#(L5)菌株为同一菌属，且与巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)亲缘关系最近，验证可信度达100%；4#(L4)菌株与成团泛菌(Pantoeaagglomerans)亲缘关系最近，验证可信度达100%，鉴定结果见表2。

图1　腐败细菌的扩增结果

2.3鲜莲低温贮藏过程中优势腐败菌的消长规律

由图3可知，随着贮藏时间的延长，4种优势腐败菌：分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的变化趋势大体相同，呈现先降后升的趋势，贮藏第3天时，优势腐败菌菌落数都大幅度降低，研究现象与王满生等[18]对草鱼低温贮藏过程中优势腐败菌前期先大幅降低的结果相似，可能是鲜莲采后贮藏温度突然降低至冷藏4 ℃，导致部分细胞生长受抑或遇冷死亡引起。其中，巴氏葡萄球菌变化最为明显，第3天后菌落数上升迅速，表皮葡萄球菌上升较分散泛菌变化略微明显，第3天时菌落数低于分散泛菌，但第9天其菌落数超过了分散泛菌。在贮藏期间成团泛菌菌落数变化无规律，可能是此菌本身的特点，易成片聚集，菌落数变化规律不明显。

图2　1#～5# 鲜莲腐败菌16S rDNA 的系统发育树

编号Blast相似性最高菌株种群1#分散泛菌(Pantoeadispersa)2#表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)3#和5#巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)4#成团泛菌(Pantoeaagglomerans)

因3# 和5#属于同一菌属，故合并统计

3　结论

本研究分离鉴定得到了鲜莲4 ℃贮藏过程中的4种优势腐败菌，即分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和成团泛菌(Pantoeaagglomerans)；明确了其在贮藏期间的消长规律，随着贮藏时间的延长，分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的生长趋势大体相同，呈现先降后升的趋势，巴氏葡萄球菌变化最为突出，第3天后菌落数上升迅速，表皮葡萄球菌上升较分散泛菌变化略微明显，贮藏期间成团泛菌菌落数变化无规律。当前研究分离鉴定了鲜莲4 ℃贮藏过程中的优势腐败菌种类，初步掌握了其各自的消长规律，然而，对其优势腐败菌的致腐能力及其致腐机理尚需进一步深入探讨，对鲜莲低温贮藏新技术的开发及其产品的研发有待进一步开展集成研究。

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The dominant spoilage bacteria and their growth and decline law in fresh lotus seeds storedat the cold storage

WANG Jian-huiWANGXiuWANGFa-xiangLIXiang-hongYUjianJINNaLIUYong-le

(HunanProvincialEngineeringResearchCenterforFoodProcessingofAquaticBioticResources,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China)

In this study, spoilage bacteria in fresh Xiang lotus seeds preserved at 4 ℃ temperature for 18 d were separated by dilution-plate method. Total genomic DNA was extracted from these strains and then subjected to PCR amplification. Dominant spoilage bacteria were identified using 16S rDNA sequencing for the identification and the law of their growth and declination was drawn. The results showed the four dominant spoilage bacteria in fresh Xiang lotus seeds preserved at the temperature of 4 ℃ werePantoeadispersa,Staphylococcusepidermidis,Staphylococcuswarneri, andPantoeaagglomerans. At the storage temperature of 4 ℃, the growing trends ofPantoeadispersa,Staphylococcusepidermidis,Staphylococcuswarneriof fresh lotus seeds were similar, which all needed an adaptive phase before their increase. The amount change ofPantoeaagglomeranswas irregular.

Fresh Lotus; Cold storage; dominant spoilage bacteria; identification; growth and decline law

国家自然科学基金青年科学基金项目(编号：31301564，31201427)；湖南省自然科学基金项目(编号：2015JJ2011)；湖湘青年英才支持计划项目(编号：2015RS4051)

王建辉，男，长沙理工大学教授，博士。

刘永乐(1962-)，男，长沙理工大学教授，博士。

E-mail:LYLE19@163.com

2016-06-07

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.026