张　帆颜鸿飞戴洁云吴　波黄志强张　莹王美玲

(1. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙　410004；2. 湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙　410004；3. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙　410004)



食品多组分添加剂及非法添加物的HPLC—HRMS广谱筛查

张帆1,2颜鸿飞2,3戴洁云3吴波3黄志强2,3张莹2,3王美玲2,3

(1. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙410004；2. 湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙410004；3. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙410004)

采用离子阱飞行时间串联质谱(LCMS-IT-TOF) 技术对葡萄酒、果汁等饮料中多组分添加剂和禁用染料进行快速筛查和确证。构建了合成色素、甜味剂、禁用染料等41种化合物的精确分子质量数和多级质谱碎片离子数据库。样品经甲醇—水(体积比1∶1)稀释后，以C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)分离，甲醇和2 mmol/L乙酸铵为流动相梯度洗脱。筛查检出限为0.005～1.000 mg/kg。在3个添加浓度下平均回收率41.2%～114.1%，相对标准偏差(RSD) 为4.3%～16.4%。利用精确质量数和数据库中质谱图的检索匹配度实现快速筛查；结合保留时间、同位素丰度和多级特征碎片离子对目标化合物进行确证。该方法具有简便快速、准确、灵敏度高等优点，同时可实现无标准物质的情况下，较短时间内完成对食品中可能存在的添加剂和非法添物进行筛查检测，缩短检测时间，提高检测效率。

食品；添加剂；非法添加物；筛查；高分辨质谱

食品添加剂种类繁多，包括着色剂、防腐剂、抗氧化剂、甜味剂、水分保持剂、稳定剂等。食品中限用色素常用的检测方法主要有分光光度法[1]、液相色谱法[2]、液相色谱/质谱联[3]和毛细管电泳法[4-5]。对于防腐剂和抗氧化剂的检测技术目前主要有液相色谱法[6-7]、气相色谱[8]、离子色谱法[9]、薄层色谱法、红外光谱法以及色谱—质谱联用[10]技术。甜味剂的检测有气相色谱法[11]和液相色谱法[12]以及气相色谱/质谱联用法和液相色谱/质谱联法[13]。

中国现有的检测标准和文献方法所能覆盖的食品添加剂品种和范围有限，尤其是要对待测物进行准确的定性分析和定量分析需要在获得待测物的标准物质的条件下才能进行，不能同时筛查食品中不含特定目标物的多组分添加剂和非法添加物，因此很难通过技术手段对不法商贩的违法行为进行监测。离子阱飞行时间串联质谱(LCMS-IT-TOF)兼具离子阱和高分辨飞行时间质谱的检测能力，能够进行分子量的精确测定，同时还能提供多级质谱碎片离子信息，使被测化合物的筛查和确证更加简便化[14]。

本研究系统拟建立41种食品添加剂和非法添加物的多级质谱高分辨质谱数据库。采用离子阱飞行时间串联质谱技术建立食品中多组分添加剂的快速筛查和确证技术平台。通过检索匹配待测化合物的精确质量数，实现食品中多组分添加剂和非法添加物的快速筛查，并使用待测物的二级、三级特征碎片离子进行确证。对于已有标准物质的目标化合物可同时进行定性识别和准确定量；对无标准品的未知添加物可进行分子式预测和结构鉴定。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

10种食用合成色素(苋菜红、新红、柠檬黄、日落黄、胭脂红、赤藓红、亮蓝、亮黑、喹啉黄、偶氮玉红)标准物：纯度均大于≥95%，德国Dr. 公司；

10种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甘草酸单铵盐、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷、抗坏血酸葡糖苷)标准物：纯度均大于≥95%，德国CNW公司；

21种禁用工业染料(萘酚黄、橙黄G、酸性紫7、酸性红2G、酸性绿50、坚牢绿、酸性红 26、丽春红SX、酸性绿5、丽春红3R、荧光素钠、酸性红87、酸性黑、酸性蓝 1、酸性红52、专利蓝Ⅴ钙盐、酸性绿9、酸性橙 I、酸性红 88、酸性紫43)标准物：纯度均大于≥95%，美国sigma 公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司；

其余试剂均为分析纯；

试验用水为超纯水：美国Millipore公司。

1.1.2主要仪器

液相色谱—离子阱—飞行时间串联质谱：LCMS-IT-TOF型，配LC MS solution V 3.6工作站，日本岛津公司；

涡旋混匀器：SK-1型，常州澳华仪器有限公司；

高速离心机：Sigma 2-16P型，德国Sigma公司。

1.2试验方法

1.2.1标准工作溶液配制准确称取10.0 mg(精确至0.000 1 g)标准品置于10 mL棕色容量瓶中，用超纯水配制定容至刻度，使标准储备液浓度约1.0 mg/mL，4 ℃下避光保存。每次试验前用超纯水对述标准储备液进行稀释，配制成不同浓度的混合标准工作溶液。

1.2.2样品前处理移取1.0 mL液体试样于10 mL容量瓶中，用甲醇—水(体积比1∶1)稀释并定容至刻度，取上清液12 000 r/min离心5 min后，上机供测试。

1.2.3色谱条件色谱柱：Agilent SB- C18柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；流动相A：2 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0～8 min，10% B～50% B；8～15 min，50% B～95% B；15～20 min，95% B；20.1～26 min，10% B。柱温为30 ℃；进样体积为10 μL，流速：0.5 mL/min。

1.2.4质谱条件离子源：ESI负离子扫描；扫描范围：MS1m/z200～400，MS2m/z50～400，MS3m/z50～400；CDL温度：200 ℃；加热模块温度：200 ℃；干燥气体压力：100 kPa；雾化气流速：1.5 L/min；离子源电压：-3.5 kV；检测器电压：1.6 kV；质量数校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数。高分辨数据采集系统为LC-MS solution V 3.6。

2　结果与分析

2.1前处理条件的优化

为减少待测目标物在提取和净化过程中的损失，用甲醇—水(体积比1∶1)稀释后，直接进样。通过加标回收试验发现：水溶性化合物中，尼龙过滤器对水溶性色素具有较强的吸附作用，滤膜上留有颜色，回收率严重偏低。混合纤维素酯对色素也有一定吸附作用，但回收率降低；聚醚砜过滤器对大部分色素吸附作用最小，对赤藓红虽有一定的吸附作用，但损失率达到50%以上。因此采用不过过滤器，提取液在12 000 r/min高速离心5 min后，取上清液直接进样。

2.2色谱—质谱条件优化

2.2.1色谱条件的选择待测水溶性着色剂和工业染料大部分为酸性化合物，为了获得较高的仪器灵敏度通常采用负离子模式。由于在待测的着色剂分子结构中存在易离子化的磺酸根基团，当试验过程中选择乙酸铵溶液为流动相时，可有效促进目标物在色谱柱上的保留和分离，改善化合物峰形，增强质谱响应，并使多组分得到良好分离。同时考察了乙酸铵的浓度对添加剂信号强度的影响，选用的乙酸铵的浓度分别为0，1，2，5，10，20 mmol/L。结果表明，当流动相中不加入乙酸铵或乙酸铵浓度较低时，这些目标化合物的色谱峰形在样品及环境的 pH值影响下，离子化效果不理想，同时质谱响应也较弱；当在流动相中加入2 mmol/L的乙酸铵后，质谱响应信号变得比较理想；随着乙酸铵浓度的不断增大，溶液中的离子强度也相应增大，但各待分析物的信号强度反而下降，特别是酸性紫7、酸性绿9、胭脂红、柠檬黄、赤藓红、苋菜红等色素的信号下降尤为明显，此现象说明流动相中缓冲盐浓度过大对目标化合物的电离有抑制作用，使质谱信号响应值降低。此外，长期使用过高浓度的缓冲盐，容易在色谱分离时使色谱柱中出现盐析，造成管路堵塞，柱子分离效果降低。同时试验还考察了2 mmol/L乙酸铵和2 mmol/L乙酸铵—甲酸、2 mmol/L乙酸铵—乙酸酸缓冲体系的影响，结果表明，在负离子模式下，流动相中不宜添加甲酸或乙酸，因酸性条件不利于离子化。综合考虑，本研究采用2 mmol/L 的乙酸铵—甲醇溶液作为流动相。

2.2.2质谱条件的选择对于水溶性化合物，合成色素或酸性工业染料中由于分子结构中含有Na(或Ca)，其中的Na离子(或Ca离子)在进行负离子模式电离过程中首先丢失，形成带一个或多个电荷的分子离子峰[M-nNa+mH](n-m)-。如柠檬黄为[M-3Na+H]2-，荧光素钠为[M-2Na+H]-、诱惑红为[M-2Na]2-。质谱图中主要观察到[M-H]-、[M-2H]2-离子峰，更高价态分子离子较少见。阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜等含有OH，易失去H+，形成[M-H]-离子。甜蜜素、糖精钠和安赛蜜，含Na+或K+，在失去所有Na+或K+后，无位点或部分位点与H+结合，最终形成[M-nNa(K)+mH] (n-m)-离子。待测目标物的加合离子类型，精确质量数理论值、精确质量数测定值、质量误差以及多级碎片离子信息见表1。同分异构体(精确分子质量数相同的化合物)经液相分离后能通过保留时间和多级特征碎片离子进行区分。

2.3基质效应

基质抑制效应普遍存在各类质谱分析技术中，大多数情况下难以彻底消除。由于本方法前处理步骤简单，对葡萄酒、饮料等液体样品，直接用甲醇—水(体积比1∶1)稀释进样，没有进行更多的净化步骤。因此需考察基质效应的影响。本研究采用提取后添加法对基质效应进行评价，基质效应按式(1)计算。试验结果表明，葡萄酒和果汁基质经稀释后直接进样，所产生的基质效应不是特别明显，回收率均在可接受的范围内。

(1)

式中：

ME——基质效应；

Am——样品基质提取后添加的信号峰面积平均值；

AS——标准品溶液的质谱信号峰面积平均值。

2.4定性筛查及确证

在试验优化的条件下，对实际样品进行分析，所获得的高分辨质谱数据，通过MetID solution 筛查软件，根据化合物的精确质量数进行自动匹配定性筛查，初步判为阳性结果，再经多级谱图扫描，同时，检索自建的质谱数据库，再通过化合物的二级或三级特征碎片离子与标准数据库的匹配度进行确证。由于本筛查方法是一个开放的体系，可以增加待测目标物的分子式，精确质量数和保留时间的数据库，只需要一次进样，即可完成所有化合物的筛查。综上所述，本筛查方法能够在不需要标准物质的情况下对41种食品添加剂和非法添加物进行有效筛查，并利用二级质谱库对其结构进行确认。图1、2分别为阿巴斯甜阳性样品的提取离子流图和多级质谱图。

2.5线性范围、定性筛查检出限

根据筛查化合物的响应强弱，配制一系列不同浓度的混合标准工作溶液进行分析，以各待测组分的峰面积(X)对质量浓度(Y)绘制标准曲线，得到各待测组分的线性回归方程和线性相关系数，外标法定量。由于高分辨率质谱的提取精确质量数的色谱图噪声很小，方法检出限根据美国国家环境保护局(EPA)推荐方法获得，即制备一份相对浓度较低的加标样品，重复进样7次后，然后根据测试值的标准偏差来确定方法的检出限(MDL)。线性范围、相关系数、检出限(MDL)见表2。

图1　阿斯巴甜提取离子流图

图2　阿斯巴甜的多级质谱图

2.6方法回收率及精密度

以阴性样品进行了添加回收试验，3个浓度水平都平行测定6次，计算添加回收率和相对标准偏差。试验结果(见表2)表明，41种化合物在低、中、高3个加标水平的回收率在41.2%～114.1%，相对标准偏差(RSD)在4.3%～16.4%。

2.7实际样品筛查及检出率结果

为了评价该方法的实用性，随机从超市及流动市场个体商贩处购买了果汁类、碳酸型饮料、葡萄酒、糖果等25份样品进行筛查，筛查结果显示，绝大部分饮料中的合成色素、甜味剂、防腐剂均在GB 2760—2014标准要求范围之内，个别样品超出限量要求，例如1个果汁样品中的柠檬黄检出结果为0.15 g/kg，1个果汁样品中检出含有甜菊糖苷，而标签则宣称不含甜味剂。禁用工业染料未有检出，需进一步扩大筛查范围和样品种类。

表1　41种化合物的分子式、保留时间、精确质量数、主要碎片离子

表2　葡萄酒中41种化合物的线性范围、相关系数、检出限、平均回收率及相对标准偏差

续表2

化合物名称线性范围/(ng·mL-1)r2添加水平/(mg·kg-1)平均回收率/%RSD/%MDL/(mg·kg-1)酸性红2G20～5000.9980.5097.510.21.00113.79.82.00111.111.80.200酸性绿5020～5000.9990.50103.512.01.0095.19.72.00102.510.60.200三氯蔗糖3～1000.9940.0570.74.31.0094.78.42.0087.96.10.030坚牢绿20～5000.9980.5077.96.51.0093.18.02.00114.112.20.200酸性红2610～5000.9920.5095.58.51.0096.86.32.0096.312.40.100丽春红SX10～5000.9990.5059.511.91.0063.89.52.0064.910.40.100偶氮玉红20～5000.9980.5091.78.21.0097.15.72.00101.312.50.200亮蓝10～5000.9910.5055.97.71.0069.68.72.0075.66.50.100酸性绿510～5000.9980.5055.612.11.0072.510.32.0089.08.60.100阿斯巴甜1～1000.9930.0567.713.61.0080.28.02.0094.56.40.010丽春红3R10～5000.9940.5092.54.41.0095.712.12.0093.110.00.100荧光素钠5～5000.9980.0551.69.31.0087.69.92.0088.06.30.050酸性红8725～5000.9950.5074.510.91.0092.47.52.0093.311.10.250酸性黑25～10000.9950.5064.310.81.0090.39.02.0088.411.20.250酸性蓝110～5000.9900.5080.29.11.0085.39.92.00104.410.80.100

续表2

化合物名称线性范围/(ng·mL-1)r2添加水平/(mg·kg-1)平均回收率/%RSD/%MDL/(mg·kg-1)甘草酸单铵盐50～10000.9950.5095.37.01.00107.46.22.0088.74.40.500阿力甜1～1000.9990.0595.59.31.00102.28.52.00101.26.60.010酸性红523～1000.9910.0590.610.51.0087.89.82.00110.611.30.030酸性蓝3钙盐;专利蓝Ⅴ钙盐5～5000.9930.0589.612.61.0089.59.22.0099.610.50.050赤藓红50～10000.9960.5066.211.81.0079.911.02.0085.05.80.500酸性绿925～10000.9990.5048.57.31.0053.711.42.0070.310.10.250酸性橙I1～1000.9980.0574.210.71.0088.011.52.00102.99.30.010酸性红880.5～100.9930.0561.112.01.0082.48.42.0092.511.20.005酸性紫435～1000.9970.0571.29.21.0075.19.42.0095.86.60.050纽甜1～1000.9990.0596.95.41.0097.58.42.00102.59.70.050甜菊糖苷10～5000.9940.5053.56.31.0051.88.62.0068.811.90.100

3　结论

本研究构建了合成色素、甜味剂、禁用染料等41种化合物数据库，建立了葡萄酒、果汁等饮料中多组份添加剂和禁用染料的快速筛查和确证方法。该方法适用于以筛查为目的定性分析。方法简便快速、准确、灵敏度高，成功应用于实际样品的筛查分析。即使在缺少标准物质的情况下，也可通过精确质量数对未知化合物进行快速筛查，并使用多级特征碎片离子进行确证。

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Wide-scope screening of multiple and illegal additives in foods by high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry

ZHANG Fan1,2YANHong-fei2,3DAIJie-yun3WUBo3HUANGZhi-qiang2,3ZHANGYing2,3WANGMei-ling2,3

(1.ChangshaEnvironmentalProtectionCollege,Changsha,Hunan410004,China;2.HunanAcademyofScienceandTechnologyforInspectionandQuarantine,Changsha,Hunan410004,China;3.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China)

A method was developed screening, confirming and quantifying multiple additives and banned dyes in wine, juice and other beverages by liquid chromatography-ion trap-time of flight tandem mass spectrometry (LC-MS-IT-TOF). The accurate and multiple-stage mass spectrometry database of 41compounds was established. The analytes in samples were diluted with water-methanol (v/v). In the chromatographic analysis, target compounds were separated on a C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) with the gradient elution using the mobile phases of methanol and 2 mM ammonium acetate. The results showed that the limits of detection were 0.005～1.0 mg/kg. The method validation was carried out at three spiking levels, and the recoveries were 41.2%～114.1%, with the relative standard deviations (RSDs) of 4.3%～16.4%. The screening of analytes was performed by precision mass matching and library searching. The retention time, isotopic abundance and multiple-stage ion mass spectral was employed in this confirmation. This method is simple, fast, credible and highly sensitive and can be applied to screening both multiple and illegal additives in foods without reference standards, reducing the analytical time and improving detection efficiency.

foods; additives; illegal additives; screening; high resolution mass spectrometry

“十二五”国家科技支撑计划课题资助(编号：2012BAK08B01)；粮油深加工与品质控制湖南省2011协同创新项目资助

张帆，女，长沙环境保护职业技术学院讲师，博士。

王美玲(1979—)，女，湖南出入境检验检疫局高级工程师，博士。E-mail: wangmeiling819@126.com

2016—06—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.011