霍仕霞，高莉，彭晓明，李建梅，陈西敬，文彦丽，闫明*

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 新疆维吾尔医方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐 830049； 2.中国药科大学 药物代谢与动力学研究中心，江苏 南京 211198)

·基础研究·

毛蕊花糖苷在大鼠、比格犬体内的药代动力学比较△

霍仕霞1，高莉1，彭晓明1，李建梅1，陈西敬2，文彦丽2，闫明1*

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 新疆维吾尔医方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐 830049； 2.中国药科大学 药物代谢与动力学研究中心，江苏 南京 211198)

目的：采用LC-MS/MS法测定毛蕊花糖苷单次、多次给药后在大鼠和比格犬血浆中的浓度，并对其在两种动物体内的药代动力学特征进行比较。方法：SD大鼠单次、多次灌胃给予毛蕊花糖苷40 mg·kg-1和静脉注射10 mg·kg-1，比格犬单次、多次灌胃给予毛蕊花糖苷20 mg·kg-1和静脉注射5 mg·kg-1后，于不同时间点采血，用DAS 2.0软件拟合并计算药代动力学参数。结果：毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬体内吸收符合一级动力学，比格犬的达峰时间和最大血药浓度是大鼠的两倍多，比格犬吸收的速率和清除率明显小于大鼠；表观分布容积结果表明毛蕊花糖苷在大鼠某一脏器组织有特异性分布，在比格犬体内无特异性分布；比格犬血药浓度-药时曲线下面积较大鼠的高，表明毛蕊花糖苷在比格犬体内吸收程度较高，药物滞留时间也较长。结论：毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬体内的药代动力学特征差异较大。

毛蕊花糖苷；大鼠；比格犬；单次给药、多次给药；比较

毛蕊花糖苷又名麦角甾苷、类叶升麻苷、阿克苷(化学结构式见图1)，是苯乙醇苷类化合物之一，广泛分布于肉苁蓉、地黄、连翘等多种植物中。该化合物具有增强记忆及保护神经、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等药理作用[1-4]。由于其生物活性强、毒副作用小且来源广泛，受到国内外众多研究者的重视。课题组前期参考相关文献[5]采用LC-MS/MS法测定了生物样品中毛蕊花糖苷的含量，在满足有效给药浓度前提下，进行了毛蕊花糖苷在大鼠体内的吸收、分布及排泄研究[6-7]，以及在比格犬体内的吸收研究[8]。本研究在此基础上，完成了毛蕊花糖苷多次重复给药后在大鼠、比格犬体内的吸收研究，并进行了大鼠、比格犬静脉注射毛蕊花糖苷的研究，比较了毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬体内吸收药时曲线及药代动力学(药动学)参数的不同，考察其在啮齿和非啮齿类动物体内药动学差异，为药效评价及后期的新药开发研究提供参考。

图1 毛蕊花糖苷的化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-10ADvp(日本岛津公司)液相色谱系统和TSQ Quantum Access 三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源(ESI)源及 Xcalibur 2.0.7 数据处理系统(美国 Thermo Scientific公司)；操作软件DAS 2.1.1；BS 221电子天平(Mettler Toledo公司)；旋转离心浓缩仪(美国LABCONCO公司)；5430-R高速冷冻离心机(Eppendorf公司，离心半径13.5 cm)；BCD-281E冰箱(Electrolux)，FORMA 700 SERIES低温冰箱(Thermo SCIENTIFIC)等。

1.2 材料

清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)20140013；比格犬，雌雄各半，体重8～10 kg，上海新冈实验动物场提供，合格证号：SCXK(沪)20140014。

药品：毛蕊花糖苷，课题组自制(批号：201320322，含量大于99.0%，HPLC进行测定，外标法定量)。染料木素(内标)，含量：95%，由中国食品药品检定研究院提供。乙酸乙酯(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司，批号：20140827)；甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

BDS HYPERSIL C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm，2.4 μm，Thermo Scientific)，柱温：40 ℃，水相(A)：0.1%甲酸水溶液，有机相(B)：乙腈，按程序梯度洗脱(0～0.6 min，10%B；0.6～1.0 min，10%～70% B，1.00～4.00 min，70%；4.00 ～4.50，70%～10% B；4.50～6.00，10% B),流速：0.30 mL·min-1。

质谱条件：离子源为电喷雾离子化源(ESI)；电喷雾压为3300 V；加热毛细管温度为350 ℃；鞘气(N2)压力为40 Arb，辅气压力(N2)为15 Arb；检测方式为正离子检测；扫描方式为选择反应检测(SRM)；用于定量分析的离子反应分别为m/z623.2→160.9(毛蕊花糖苷)和m/z269.0→133.1(染料木素)。

2.2 样品制备

2.2.1 毛蕊花糖苷储备液的制备 精密称取毛蕊花糖苷适量，甲醇溶解配制成200 ng·mL-1的对照品溶液，染料木素适量，甲醇溶解稀释制备成1.5 μg·mL-1的内标溶液，4 ℃保存备用。

2.2.2 血浆样品的处理方法 取内标溶液30 μL，使用低温旋转浓缩仪挥干，加入50 μL的大鼠血浆样品，加入400 μL的乙酸乙酯溶液，涡旋混匀10 min，16 000 r·min-1离心10 min，然后取上清液350 μL，挥干，100 μL甲醇复溶，涡旋混匀1 min，16 000 r·min-1离心10 min，取上清液10 μL以内标法进行LC-MS/MS测定。

2.3 大鼠的单剂量给药

SD大鼠6只，♀、♂各半，体重180～220 g，禁食12 h，按40 mg·kg-1剂量灌胃给予毛蕊花糖苷。给药前取空白血，分别于给药后5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min经眼底静脉取血，置加有肝素的Eppendorf管中，离心，取上层血浆-70 ℃保存供测试。

2.4 大鼠的多剂量给药

SD大鼠6只，♀、♂各半，体重180～220 g，禁食12 h，按40 mg·kg-1剂量灌胃给予毛蕊花糖苷。每隔24 h给药1次，共给药6次。给药前取空白血，第6次给药后于5、10、15、30、45、60、120、180、240、300 min经眼底静脉取血，置加有肝素的Eppendorf管中，离心，取上层血浆-70 ℃保存供测试。

2.5 大鼠静脉注射给药

SD大鼠6只，♀、♂各半，体重180～220 g，按10 mg·kg-1剂量静注给予毛蕊花糖苷。给药前取空白血，分别于给药后不同时间点经眼底静脉取血，置加有肝素的试管中，离心，分取血浆于离心管里，-70 ℃保存供测试。

2.6 比格犬单剂量给药

比格犬4只，♀、♂各半，体重10～12 kg，禁食12 h，按20 mg·kg-1剂量灌胃给予毛蕊花糖苷。给药前取空白血，分别于给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min经前肢静脉取血，置加有肝素的Eppendorf管中，离心，取上层血浆-70 ℃保存供测试。

2.7 比格犬多剂量给药

比格犬4只，♀、♂各半，体重10～12 kg，按20 mg·kg-1剂量灌胃给予毛蕊花糖苷。每隔24 h给药1次，共给药6次。给药前取空白血，第6次给药后于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min经前肢静脉取血，置加有肝素的Eppendorf管中，离心，取上层血浆-70 ℃保存供测试。

2.8 比格犬静注给药

比格犬4只，♀、♂各半，体重8～10 kg，按20 mg·kg-1剂量灌胃给予毛蕊花糖苷。给药前取空白血，分别于给药后不同时间点经前肢静脉取血，置加有肝素的Eppendorf管中，离心，取上层血浆-70 ℃保存供测试。

2.9 数据处理

将血药浓度-时间数据以DAS 2.1.1程序拟合，并利用统计距法计算峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、清除率(Cl)、分布容积(V/F)等药动学参数。其中Cmax和Tmax为实测值，C-t曲线尾段相消除速率常数k为lnC-T直线回归所得，AUC0-t值为梯形面积法计算所得，0-∞时间的曲线下面积AUC=AUC0-t+ Ct/k，Ct为实验中最后一点的血药浓度，k为血药浓度尾段相消除速率常数。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性实验(以大鼠单次给药为例) 在本实验条件下，毛蕊花糖苷的保留时间约为2.58 min，内标染料木素的保留时间约为2.77 min。通过对来自6只不同大鼠的空白血浆测定表明，血浆中的内源性杂质不干扰样品测定，大鼠的空白血浆、空白血浆添加毛蕊花糖苷和内标(染料木素)及单剂量大鼠灌胃给药(40 mg·kg-1)30 min的血浆样品的色谱图见图2。

3.1.2 线性方程 以样品和内标峰面积比As/Ais为纵坐标，质量浓度C (ng·mL-1)为横坐标，以1/C2为权重系数进行回归，得血浆样品中毛蕊花糖苷的线性方程及回归系数，结果见表1。

表1 大鼠、比格犬血浆中毛蕊花糖苷线性方程

3.1.3 定量下限 将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20时的药物浓度作为本测定方法的定量下限，经测定本方法加入质量浓度为10 ng·mL-1，大鼠、比格犬的定量下限均为10 ng·mL-1，见表2。

表2 大鼠、比格犬血浆中毛蕊花糖苷的定量下限实验 (n=5)

3.1.4 相对回收率试验 取Eppendorf 管若干，分为3组，每组5个，分别加入毛蕊花糖苷质量浓度为20、200、4000 ng·mL-1的对照品溶液50 μL，经真空离心浓缩仪挥干后，按2.2.2项下操作，测定结果带入血浆标准曲线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得血浆中毛蕊花糖苷的相对回收率。结果表明，各浓度的相对回收率均符合生物样品分析要求，大鼠、比格犬相对回收率结果见表3、4。

注：A.空白血浆；B.含内标染料木素血浆；C.含毛蕊花糖苷血浆；TR.保留时间；AA.峰面积；SN.信噪比。图2 空白大鼠血浆样品LC-MS/MS图谱

(%)

表4 比格犬血浆中毛蕊花糖苷测定的相对回收率试验(n=5) (%)

3.1.5 绝对回收率试验 取Eppendorf 管若干，分为3组，每组5个，分别加入毛蕊花糖苷质量浓度为20、200、4000 ng·mL-1的对照品溶液50 μL，经真空离心浓缩仪挥干后，按2.2.2项下操作，测定结果的峰面积与相同浓度对照品溶液直接进样的峰面积相比，算得血浆中毛蕊花糖苷的绝对回收率。结果表明，各浓度的绝对回收率均符合生物样品分析要求，见表5、6。

表5 大鼠血浆中毛蕊花糖苷测定方法的绝对回收率试验 (n=5) (%)

表6 比格犬血浆中毛蕊花糖苷测定的绝对回收率试验 (n=5) (%)

3.2 大鼠单次、多次重复给药后的药动学实验结果

大鼠按40 mg·kg-1剂量单次、多次灌胃给药后的平均血药浓度-时间曲线见图3、4，通过统计距所计算出得药动学参数见表7。

图3 大鼠单次给药血药浓度-时间曲线

图4 大鼠多次给药血药浓度-时间曲线

参数单位单次多次AUC(0⁃t)mg·mL-1·min-12139±4032027±794AUC(0⁃∞)mg·mL-1·min-12239±3892118±769MRT(0⁃t)min8174±4007879±1014MRT(0⁃∞)min9652±7939573±2220t1/2min6679±12107365±1725Tmaxmin1750±10371750±987ClL·min-1·kg-1183±030205±054V/FL·kg-117910±527722717±10451Cmaxmg·L-10313±0040349±017

3.3 比格犬单次、多次重复给药后的药动学实验结果

比格犬按20 mg·kg-1剂量单次、多次灌胃给药后的平均血药浓度-时间曲线见图5、6，通过统计距所计算出得药动学参数,见表8。

图5 比格犬单次给药血药浓度-时间曲线

图6 比格犬多次给药血药浓度-时间曲线

参数单位单次多次AUC(0⁃t)mg·mL-1·min-18786±13337993±545AUC(0⁃∞)mg·mL-1·min-18951±13158224±514MRT(0⁃t)min10157±104910430±1143MRT(0⁃∞)min11150±124311960±1687t1/2min9327±21489985±3484Tmaxmin4125±14363375±750ClL·min-1·kg-1023±003024±002V/FL·kg-13116±11253538±1397Cmaxmg·L-10893±0060824±017

3.4 大鼠、比格犬静脉注射给药后的药动学实验结果

大鼠、比格犬分别按10 mg·kg-1、5 mg·kg-1剂量静脉注射给药，平均血药浓度-时间曲线见图7、8，通过统计距计算出得药动学参数,见表9。

图7 大鼠静脉注射毛蕊花糖苷的血药浓度-时间曲线

图8 比格犬静脉注射毛蕊花糖苷的血药浓度-时间曲线

参数单位大鼠(10mg·kg-1，n=6)犬(5mg·kg-1，n=4)AUC(0⁃t)mg·mL-1·min-144501±691557269±8531AUC(0⁃∞)mg·mL-1·min-144568±691157520±8678MRT(0⁃t)min1436±1544758±640MRT(0-∞)min1467±1664986±760t1/2min2300±2637546±1620ClL·min-1·kg-1002±000001±000VL·kg-1077±019096±024Cmaxmg·L-140481±632 17031±231

4 讨论

本实验测定了毛蕊花糖苷单次、多次重复灌胃给药和静脉注射给药后在大鼠及比格犬中的血浆药物浓度并计算出相关的药动学参数。大鼠以单次灌胃给予40 mg·kg-1剂量的毛蕊花糖苷为例，其峰浓度Cmax为0.313 ng·mL-1，达峰时间Tmax为17.5 min，半衰期t1/2为66.79 min，清除率Cl和分布容积V/F分别为1.83 L·min-1·kg-1和179.10 L·kg-1。比格犬以灌胃给予20 mg·kg-1剂量的毛蕊花糖苷为例，其峰浓度Cmax为0.893 ng·mL-1，达峰时间Tmax为41.25 min，半衰期t1/2为93.27 min，清除率Cl和分布容积V/F分别为0.23 L·min-1·kg-1和31.16 L·kg-1。利用SPSS软件对单剂量给药和多剂量给药后毛蕊花糖苷在大鼠及比格犬体内的主要药动学参数进行统计分析，发现各药动学参数均不存在统计学差异，证明多剂量给药后，毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬体内均不存在蓄积现象。

动物的种属不同，药物的吸收代谢有很大的差别，犬和大鼠与人在药物吸收代谢方面属于中等相似。本研究分别考察了毛蕊花糖苷口服和静脉注射给药后在啮齿类动物大鼠和非啮齿类动物比格犬体内吸收的差异，口服给药后毛蕊花糖苷在啮齿类动物大鼠和非啮齿类动物比格犬体内吸收虽然符合一级动力学，但药动学参数存在很大差异，比格犬的达峰时间和最大血药浓度是大鼠的两倍多，犬吸收的速率和清除率明显小于大鼠，表观分布容积结果也可以看出药物在大鼠血浆中分布的少，其表观分布容积远远大于100，超过了体液的总容积，表明毛蕊花糖苷在大鼠某一脏器组织有特异性分布，而药物在比格犬的血浆中分布多，其表观分布容积只有30多，表明毛蕊花糖苷在比格犬体内能够分布于细胞内液、细胞外液，分布较广，无特异性分布于某个组织；比格犬血药浓度-药时曲线下面积较大鼠的高，表明毛蕊花糖苷口服后在比格犬体内吸收程度较高，在比格犬体内的药物滞留时间也较大鼠长[9]；静脉注射给予毛蕊花糖苷后，结果比格犬的达峰时间是大鼠的两倍多，表观分布容积及清除速率差异较小，但可能由于大鼠和比格犬生理结构上的差异，毛蕊花糖苷在比格犬体内的药物滞留时间比大鼠长，与口服给药结果一致。

由此我们可以看出，同一药物在不同动物体内药代动力学特征差异较大，药物作用的强弱和药效持续时间的长短也不同，这些种属间的差异，为后期对其进行制剂研究、安全性评价及毒理代谢动力学研究提供参考，并有助于指导药物临床研究和应用，减少药物的危险性[10]。

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ComparisonofPharmacokineticsafterAdministrationofActeosideinRatandBeagleDog

HUO Shixia1，GAO Li1，PENG Xiaoming1，LI Jianmei1，CHEN Xijing2，WEN Yanli2，YAN Ming1*

(1.XinjiangInstituteofTraditionalUighurMedicineXinjiangLaboratoryofUighurMedicalPrescription，Urmuqi830049，China；2.CenterofDrugMetabolismandPharmacokinetics，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing211198，China)

Objective：The plasma concentration of acteoside in rats and beagle dogs were determined by LC-MS/MS，and the pharmacokinetics in rats and beagle dogs were compared.Methods：SD rat were given 40 mg·kg-1acteoside in single and multiple doses viaig，and given 10 mg·kg-1acteoside viaiv.Beagle dog were given 20 mg·kg-1acteoside in single and multiple doses viaig，and given 5 mg·kg-1acteoside viaiv.Blood samples were collected at different times after administration.The pharmacokinetics were calculated by DAS 2.0 program.Results：The character of acteoside is the first-order kinetics in rats and beagle dogs，the peak time (Tmax) and peak concentration (Cmax) of beagle dogs were higher than those of rats significantly，absorption rate and clearance of beagle dogs were significantly lower than rats’；The results of apparent volume of distribution (V/F) indicated that acteoside has specific distribution in certain organs of rats’，but not in beagle dogs.The area under concentration-time curve (AUC) of beagle dogs were higher than rats’，it showed that absorption extent and residence time of acteoside in beagle dogs were all higher than rats’.Conclusion：The pharmacokinetic characteristics of acteoside were quite differences in rats and beagle dogs.

Acteoside；rat；beagle dog；single dose；multiple doses；comparison

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.008

2016-01-14)

新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项资金(2015007)

*

闫明，研究员，方向：药物分析与新药研发；Tel：(0991)2574309，E-mail：yanming21cn@sohu.com