晁生玉，张才骏，张居农

(1.青海省海西动物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大学，西宁 810016；3.石河子大学，832000)



青海省果洛藏獒血液乳酸脱氢酶同工酶酶谱的研究

晁生玉1，张才骏2，张居农3

(1.青海省海西动物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大学，西宁 810016；3.石河子大学，832000)

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对青海省果洛州39 只藏獒的血清乳酸脱氢酶(S-LDH)和红细胞乳酸脱氢酶(RBC-LDH)同工酶酶谱及其多态性进行了研究。结果发现：1)被检藏獒的S-LDH 经电泳可分离出S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5等5条区带，呈现出S-LDH1A(20.51%)和S-LDH1a(79.49%)两种电泳表型而表现出多态性；2)RBC-LDH 经电泳可分离出RBC-LDH1、RBC-LDH2和RBC-LDH3等3条区带，呈现出RBC-LDH2A(43.24%)和RBC-LDH2a(56.76%)两种电泳表型；3)S-LDH同工酶5条区带的相对电泳迁移率分别为53.0%、40.8%、25.5%、9.5%和3.8%。

藏獒；血清乳酸脱氢酶；红细胞乳酸脱氢酶；同工酶

藏獒(Tibetan mastiff)是青藏高原一种特有的古老珍贵犬种，也是被公认的惟一不惧怕暴力的犬种。因其对高原低氧、干旱、寒冷多变的气候有极强的适应性，且体大、凶悍、忠于主人以及护家性能强而深受广大牧民群众的喜爱，享有“东方神犬”的美称，由此引起了国内外许多学者的关注。

近年来，有关藏獒的生物学特性、繁殖性能、疾病防治方面的报道明显增加[1～4]。有关藏獒的血液学特性也有颇多报道，如晁生玉等对青海省德令哈藏獒的血液生化指标[5]，李动等对果洛藏獒血清蛋白质指标[6]，鲍林等对青海藏獒的血钾浓度进行了研究[7]。LDH 是动物体内参与糖酵解的重要酶类，国内外学者对各种家畜LDH 同工酶酶谱进行了广泛深入的研究，而晁生玉曾经对德令哈藏獒的血液乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)同工酶酶谱[8]做过研究，但目前尚未见青海省果洛州藏獒血液LDH 同工酶酶谱方面的资料。鉴于此，本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对果洛州藏獒的血清LDH 和红细胞LDH 同工酶酶谱进行了研究。

1　材料与方法

1.1实验藏獒

选用青海省果洛州玛沁县牧民自繁的藏獒 39只，其中公藏獒 22只，母藏獒17 只，临床健康，营养良好。实验用藏獒生活地的海拔高度在3 600～4 200 m。

1.2血样的采集与处理

将藏獒侧卧保定，剪毛消毒后，从其后肢外侧小隐静脉采取肝素钠抗凝血和非抗凝血各3 mL，非抗凝血迅速送实验室分离出血清，供血清LDH(S-LDH)同工酶酶谱分析。抗凝血经3 000 r/min 离心后倾去血浆，沉淀的红细胞用0.154 mol/L(0.9%)氯化钠溶液洗涤3 次，洗净的红细胞加入2 倍量蒸馏水，使红细胞溶解，再次离心后制成透明红色的红细胞溶血液，供红细胞LDH(RBC-LDH)同工酶酶谱分析。

1.3电泳

采用聚丙烯酰胺凝胶(PAG)垂直平板电泳法进行 LDH 同工酶酶谱的分析。电泳时，分离胶浓度为60 g/L，用pH 8.9 的Tris-HCl 缓冲液配制，浓缩胶浓度为30 g/L，用pH 6.7 的Tris-HCl 缓冲液配制，电泳槽内采用pH 8.3Tris-Gly 缓冲液。电泳时所用其他试剂按方丁等[9]描述的方法配制。电泳时使用DY-W2 型电泳仪(北京生化仪器厂出品)，DY-Ⅲ22A电泳槽(北京六一仪器厂出品)。电泳起始电流为15 mA，20 min 后增至25 mA，稳流电泳5 h。

1.4孵育与显色

电泳胶板在 37 ℃水浴条件下孵育，孵育液按方丁等[9]描述的方法配制。经50～60 min，待紫色区带清晰可见时，倾去孵育液，用蒸馏水冲洗电泳胶板后，在1.23 mol/L(7%)冰乙酸溶液中漂洗至胶板的背景呈无色为止。

1.5迁移率测定

用相对迁移率(Rf)表示，按张才骏等[10]记载的方法进行，即区带移动距离(d)与指示线移动距离(D)之比(Rf=d/D)。

2　结果

2.1S-LDH 同工酶酶谱

被检藏獒的 S-LDH 全部由5条同工酶区带组成，从阳极到阴极依次为S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5。各同工酶区带的Rf：S-LDH1 为53.0%，S-LDH2 为40.8%，S-LDH3 为25.5%，S-LDH4 为9.5%和S-LDH5 为3.8%。

2.2S-LDH 的多态性

根据 S-LDH 同工酶区带着染强度，果洛藏獒的 S-LDH1 同工酶存在高活性的S-LDH1A 和低活性的S-LDH1a 两种表型而表现出多态性(见图1)。8 只果洛藏獒的S-LDH1 同工酶为高活性者，占20.5%(8/39)，31 只果洛藏獒的S-LDH1 为低活性者，占79.5%(31/39)。

2.3RBC-LDH 同工酶酶谱

被检藏獒的 RBC-LDH 全部由3条同工酶区带组成，从阳极到阴极依次为RBC-LDH1、RBC-LDH2 和RBC-LDH3。它们的Rf 分别与S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3 相当。在3种同工酶中以RBC-LDH1 的染色强度最强(见图1)。

2.4RBC-LDH 的多态性

根据 RBC-LDH 同工酶区带着染强度，果洛藏獒的 RBC-LDH2同工酶存在高活性的RBC-LDH2A 和低活性的RBC-LDH2a 两种电泳表型而表现出多态性。16 只藏獒为高活性的RBC-LDH2A 型，其RBC-LDH2 区带浓染且宽，占43.24%(16/37)，21 只藏獒为低活性的RBC-LDH2a 型，其RBC-LDH2 区带淡染且窄，占56.76%(21/37)。

藏獒 S-LDH和 RBC-LDH电泳模式图1.RBC-LDH2A 型：2.RBC-LDH2a 型；3.S-LDH1a 型；4.S-LDH1A 型。

3　讨论

3.1关于 S-LDH 同工酶

据报道[9]，动物的 S-LDH 从阳极到阴极通常有 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和LDH5 五种同工酶。由于动物的种类不同，每种同工酶的比例可能有所差别。有关犬的 S-LDH，袁忠滨等[10]采用醋酸纤维素薄膜电泳法对新疆土种犬的 S-LDH 活性及其同工酶进行了研究，发现犬的S-LDH 也由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5 五种同工酶组成，五种同工酶的活性从高到低依次为LDH5、LDH1、LDH2、LDH3 和LDH4。晁生玉等[8]对德令哈藏獒 S-LDH 的研究也发现，藏獒的 S-LDH 同样由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5五种同工酶组成。S-LDH同工酶的活性从高到低依次为LDH3、LDH1、LDH2、LDH4 和LDH5。本实验发现果洛藏獒的S-LDH 也由五种同工酶组成。从区带的着染强度来看，各种 S-LDH 同工酶活性的排序与晁生玉等[8]的排序相同。

3.2RBC-LDH 同工酶

据Серов等[11]在绵羊、Yegorov 等[12]在卡拉库尔羊和希萨羊以及张才骏等[13，14]在藏羊和青海细毛羊中的的研究结果，绵羊的RBC-LDH 具有多态性，并证实它们受常染体位点一对共显性等位基因的控制。张才骏等[15]还发现牦牛的RBC-LDH 也存在多态性。晁生玉等[8]对德令哈藏獒RBC-LDH 的研究发现，藏獒的RBC-LDH 同工酶也存在多态性，但其多态性出现在RBC-LDH2 同工酶中，即存在高活性的RBC-LDH2A(57.89%)和低活性的RBC-LDH2a(42.11%)两种表型而表现出多态性，以RBC-LDH2A为优势表型。本实验对果洛藏獒RBC-LDH 的研究结果与晁生玉等[8]对德令哈藏獒RBC-LDH的研究结果相同，也存在高活性的RBC-LDH2A(43.24%)和低活性的RBC-LDH2a(56.76%)两种表型而表现出多态性，但以RBC-LDH2a 为优势表型。然而，经χ2 检验，果洛藏獒的RBC-LDH2 的表型频率与德令哈藏獒的没有显著的差异(P>0.05)。但藏獒RBC-LDH2 多态性的遗传规律尚待进一步加以研究证实。

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2016-05-26

晁生玉(1966-)，男，畜牧师。

E-mail：csy@163.com

张居农(1954-)，男，教授。

E-mail：zjnprof@sina.com

S829.2

A

1005-2739(2016)05-0016-04