王晓霞，赵　晨，赵祥颖，刘建军，*，张家祥

（1.齐鲁工业大学 食品与生物工程学院，山东 济南 250353；2.山东省食品发酵工程重点实验室，山东 济南 250013）

响应面法优化假单胞菌产胞外多糖发酵培养基

王晓霞1，赵晨2，赵祥颖2，刘建军1，2*，张家祥2

（1.齐鲁工业大学 食品与生物工程学院，山东 济南 250353；2.山东省食品发酵工程重点实验室，山东 济南 250013）

采用响应面法对假单胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13生产胞外多糖的发酵培养基进行优化。通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验构建回归方程，结果表明，最佳发酵培养基成分为甘油83.0 g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L、柠檬酸钠5 g/L、（NH4）2SO41 g/L、玉米浆粉7.5 g/L，在此条件下，胞外多糖的产量为10.50 g/L，约为优化前多糖产量7.9 g/L的1.3倍。

假单胞菌；胞外多糖；响应面；发酵培养基；优化

微生物胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物在生长过程中为适应周围环境的变化产生的对自身具有保护作用的生物高聚物［l］。微生物代谢产物对人类生存发展具有重大意义，它能够提高动物、植物本身的免疫力，不仅是保护细胞免受外界环境的屏障，也是细菌细胞的识别分子［2］。微生物胞外多糖因其独特的理化性质，已发展成为一类新型的发酵产品，目前已作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、保湿剂、胶凝剂、悬浮剂等广泛应用于石油、化工、食品和制药等多个领域［3-4］。野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）分泌得到的大分子多糖具有独有的高黏性、增稠性及流变特性，使其广泛应用于食品、纺织、印染等领域［5］。MATSUDA M等［6］研究表明，假单胞菌属中的Pseu domonassp.产生的硫酸盐多聚糖（sulfate polysaccharide）能够明显的增强小鼠的免疫力，表明了该多糖具有抗癌活性。胞外多糖特有的抗氧化、抗癌及抗肿瘤特性［7］，因此其具有潜在的药用价值。

响应面优化可以通过拟合回归方程以构建连续变量曲面预测模型，从而能够对影响响应的不同因子水平及其交互作用进行优化和评价，所需试验次数较少，因此被成功地应用于各种优化过程中［8-10］。前期工作从高盐、高渗环境中分离筛选到一株假单胞菌（Pseudomonassp.），本研究在单因素试验的基础上采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验［11-13］对该菌株产胞外多糖的最佳培养基进行了优化，进一步提高了假单胞菌胞外多糖的发酵产率。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

假单胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13：由山东省食品发酵工程重点实验室筛选保存。

1.1.2培养基

斜面培养基：甘油50 g/L，柠檬酸钠5 g/L，酵母浸粉5g/L，玉米浆干粉7.5g/L，（NH4）2SO41g/L，NaCl5g/L，琼脂15 g/L，pH值为7.0。

液体种子培养基：甘油50 g/L，柠檬酸钠5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值为7.0。

摇瓶/基础发酵培养基：甘油80 g/L，柠檬酸钠5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米浆干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值为7.0。

1.1.3试剂

甘油、硫酸铵（（NH4）2SO4）、柠檬酸钠、苯酚、氯化钠（NaCl）、质量分数95%浓硫酸（均为分析纯）：天津市化学试剂三厂；酵母浸粉（总氮≥10%）：安琪酵母股份有限公司；琼脂条、玉米浆干粉：山东西王集团淀粉厂。

1.2仪器与设备

BS124S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH 600数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；7200型紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HV-110高压灭菌锅：日本Hirayama公司；QYC-211卧式恒温（全温）双层培养摇床：上海新苗实验仪器。

1.3试验方法

1.3.1培养方法

种子活化：将假单胞菌接种到斜面培养基上，30℃培养，12 h。

种子培养：在500 mL锥形瓶中装入液体种子培养基50 mL，在121℃条件下，灭菌20 min，从斜面培养基挑去一环活化好的假单胞菌接入后进行摇瓶培养，30℃、180r/min振荡培养9 h。

摇瓶培养：在500 mL锥形瓶中装入摇瓶发酵培养基50 mL，将种子液按4%接种量接入到发酵培养基中，30℃、180 r/min振荡培养72 h。

1.3.2胞外多糖产量的测定［l4］

发酵液经16 000 r/min离心15 min去除菌体，取上清液加入乙醇醇沉得到沉淀，将沉淀用去离子水溶解，吸取1mL样品溶解液，加入1 mL蒸馏水，1 mL 5%苯酚和5 mL 95%浓硫酸，静置10 min，摇匀，室温下静置20 min，在波长490 nm处测定其吸光度值，根据葡萄糖标准曲线回归方程（y=0.007 8x+0.001 9，R2=0.996 4）计算得到多糖产量。

1.3.3Plackett-Burman设计

在前期单因素试验基础上，利用Plackett-Burman设计对发酵培养基中的6个主要因素进行全面考察，每个因素取高低2个水平，高水平约为低水平的1.5倍［15］，Plackett-Burman试验因素与水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments g/L

1.3.4最陡爬坡试验

通过对Plackett-Burman设计的试验结果进行分析，确定主要因子，根据回归方程各因子的系数来确定主要因子的爬坡路径和步长［16］，得到响应面试验的中心点，即各个显著因素的最佳质量浓度，确定最大响应值的区域。

1.3.5响应面分析试验方法

Plackett-Burman设计确定影响假单胞菌胞外多糖产量的3个主要因素，最陡爬坡试验确定3个主要因素响应区域的中心点，运用Box-Behnken的中心组合设计原理，从3个主要因素的响应区域各取3水平，设计3因素3水平试验进行响应面的分析，从而获得菌株高产胞外多糖的培养基组成。

2　结果与分析

2.1Plackett-Burman试验

按照N=6的Plackett-Burman设计进行试验，每组进行3次平行试验，摇瓶发酵3 d，以胞外多糖的产量为其响应值。Plackett-Burman试验设计及结果如表2所示，各个因素的效应及显著性如表3所示。

表2　Plackett-Burman设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman

表3　Plackett-Burman试验显著因子分析Table 3 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

由表3可知，在发酵培养基中，甘油，酵母浸粉，NaCl及（NH4）2SO4表现为正效应，玉米浆粉、柠檬酸钠表现为负效应。由P值的大小可知，发酵培养基中各因素对菌株发酵生产胞外多糖影响的重要性排序为D＞A＞E＞F＞C＞B，即酵母浸粉＞甘油＞NaCl＞柠檬酸钠＞（NH4）2SO4＞玉米浆粉，显著性影响（P＜0.05）的因素有酵母浸粉、甘油和NaCl。因此，选择甘油、酵母浸粉和NaCl作为显著因素进行下一步的试验。

2.2最陡爬坡试验确定试验因素水平的中心点

根据Plackett-Burman设计筛选出显著因素及效应大小的比例设定它们的变化步长，最快的逼近最佳值区域［13］。最陡爬坡试验设计结果如表4所示。

表4　最陡爬坡试验设计结果Table 4 Design and results of the steepest ascent path experiments

由表4可知，第2组试验胞外多糖产量最大，即甘油85 g/L，酵母浸粉5.5 g/L，NaCl 8.5 g/L时胞外多糖产量达到最大值，因此以此为中心点进行响应面试验分析。

2.3Box-Behnken试验设计与响应面试验分析

由上述2.2节确定了显著因子的最佳浓度范围，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，在主要因素的响应区取3个水平，运用软件Design-Expert V8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验，每个试验进行3次重复，Box-Behnken试验因素与水平如表5所示，响应面分析试验设计及结果见表6，回归方程的方差分析结果见表7。

表5　Box-Behnken试验因素与水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments

根据Box-Behnkon试验设计原理进行响应面分析试验，获得15个试验点，该15个试验点可以分为2类：一是析因点，自变量取值在X1、X2和X3所构成的三维顶点，共12个析因点；二是零点，为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差［17］。根据表6试验结果，运用Design-Expert V 8.0.6软件对其进行多元回归拟合方差分析，拟合得到的回归方程为：

由表7可知，在回归模型中，因素X12、X22、X32表现影响极其显著（P＜0.01），X1表现影响显著（P＜0.05），失拟项的P值0.260 3＞0.05，影响不显著，表明了试验误差很小，其他未知因素对该试验影响极小。决定系数R2为0.974 3＞0.9，说明模型达到了较好的拟合程度［18］，调整后的R2adj=0.944 1说明了回归方程中自说明了回归方程中自变量可以94.41%的解释胞外多糖的结果，变异系数（coefficient of variation，CV）为5.05%＜10%，信噪比（signal to noise ratio，SNR）为13.38＞4.0，说明了该方程的相关性良好，试验稳定，可信度高，也从侧面说明了回归方程的拟合性很好。

表6　响应面分析试验设计及结果Table 6 Design and results of response surface methodology

表7　回归方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4响应面交互作用结果分析［19］

固定其中的一个因素，利用软件Design-Expert做另外两个因素交互作用的曲面图及等高线图，确定甘油、酵母浸粉及氯化钠浓度对胞外多糖产量的影响结果见图1。

图1　甘油、酵母浸粉和NaCl交互作用对胞外多糖产量影响的响应曲面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glycerinum，yeast extract powder and NaCl on polysaccharide yield

由图1可知，甘油浓度、酵母浸粉浓度、氯化钠浓度相互作用对假单胞菌胞外多糖产量的影响均出现抛物面型关系，所得到的响应面都存在一个极大值点。其中甘油浓度与酵母浸粉浓度之间的交互作用最为明显。

2.5最佳培养基浓度的预测与验证

经过响应面法优化，软件Design-Expert分析得到的假单胞菌产胞外多糖的最佳培养基成分为甘油83.26 g/L、酵母浸粉5.72 g/L、NaCl 8.24 g/L，在此条件下，理论所得到的胞外多糖产量为10.32 g/L。

为了验证所得到的最佳培养基组成是否可靠，同时考虑了实际操作的可行性，将培养基成分调整为甘油83.0g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L，进行3次重复试验，得到胞外多糖的平均产量为10.50 g/L，与预测值接近，约为优化之前的最高产量7.9 g/L的1.3倍，进一步说明该模型能够很好地预测实际的发酵情况。

3　结论

本研究通过Plackett-Burman试验快速有效的从6个影响因素确定甘油、酵母浸粉和NaCl为影响胞外多糖发酵的主要因素，在此基础上进行最陡爬坡试验设计，逼近最大响应面区域，然后采用Box-Behnken试验设计，确定了3种主要影响因素的质量浓度经过验证试验，该菌种生产胞外多糖的最佳培养基成分为甘油83.0 g/L，酵母浸粉5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，柠檬酸钠5 g/L，玉米浆粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，在此条件下，胞外多糖的产量高达10.50 g/L，约为基础培养基发酵得到的胞外多糖产量7.90g/L的1.3倍。这表明响应面法在培养基优化方面具有一定的指导作用。

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Optimization of fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp. by response surface methodology

WANG Xiaoxia1，ZHAO Chen2，ZHAO Xiangying2，LIU Jianjun1，2*，ZHANG Jiaxiang2
（1.College of Food and Biological Engineering，QiLu University of Technology，Jinan 250353，China；2.Food&Fermentation Engineering Key Laboratory of Shandong Province，Jinan 250013，China）

The fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp.FJY5-13 was optimized by response surface methodology.The regression equation was established by Plackett-Burman，the steepest ascent path and Box-Behnken experiments.The results showed the optimum fermentation medium components were as followed：glycerin 83.0 g/L，yeast extract 5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，sodium citrate 5 g/L，（NH4）2SO41g/L and corn steep powder 7.5 g/L.Under the conditions，exopolysaccharide yield was10.50 g/L，which was1.3 timeshigher than thatbefore optimization（7.9 g/L）.

Pseudomonassp.；exopolysaccharide；response surface methodology；fermentation medium；optimization

Q939

0254-5071（2016）03-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.018

2015-12-30

山东省科技发展计划（2014GSF121038）

王晓霞（1986-），女，硕士研究生，研究方向为微生物技术及应用。

刘建军（1962-），男，研究员，博士，研究方向为微生物技术及应用。