边名鸿，万世旅，代　梅，李小兵

（1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000；3.汉源县国有皇木林场，四川 雅安 625000）

产酒酵母的筛选鉴定及其在小曲中的应用

边名鸿1，2，万世旅1，2，代梅1，李小兵3

（1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000；3.汉源县国有皇木林场，四川 雅安 625000）

以采自川西南片区的10种曲样中分离出的18株酵母为研究对象，以产酒能力为主要指标，通过三级筛选得到一株优良产酒酵母Y-18，经分子鉴定确定其为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。将其制作成纯种的酵母曲并和根霉曲进行复配试饭。结果表明，酵母Y-18在大米粉发酵培养基中的残糖含量最低，酒精度最高，分别为0.69 g/100 mL和10.3%vol；在60 g蒸熟大米中，添加酵母曲1.8 g、根霉曲0.5 g时，试饭酒精度最高（7.24%vol）、酸度适中、糖分最低。

产酒酵母；筛选；鉴定；小曲；应用

小曲酒是中国白酒的主要酒种之一，传统小曲酒是以小曲作为糖化剂和发酵剂，以高粱、大米、玉米、小麦等为原料酿造而成，具有一种清雅的香气和醇甜的口感。小曲白酒的生产，由于具有设备简单，投资少、点多面广、操作简便、发酵期短、出酒率高、用曲量少、原料广泛、适于地产地销等特点而深受酿酒厂家和广大消费者喜爱［1-2］。

川法小曲酒的研究主要集中在提高其产酒率和风味上，因此优良菌种的筛选及应用至关重要。李锐利［3］从收集到的小曲酒酒曲中分离筛选出一株产乙酸乙酯性能较高的酵母菌株BY2，在优化产酯条件下BY2的产酯量为4.812 g/L，较优化之前的方案产酯量提高了37.5%；邓开野等［4］从甜酒曲中经分离、诱变、筛选后得到1株高糖化力的根霉菌株，在最优培养条件下，糖化力达到1 317 mg/（h·g），具有一定应用价值；张翠英等［5］通过添加低产高级醇菌株进行小曲酒半固态发酵，小曲酒酒精度、残糖、总酸和总酯基本无影响，但却使高级醇含量大幅度下降，与纯小曲发酵相比降低了37.2%。从发酵基质和自然界中直接筛选培育耐高浓度酒精的酵母菌，是目前获取高产酒精酵母的一种既经济又实用的方法［6］，这些酵母菌在人工生产中经过不断驯化，在高产、耐高浓度酒精及遗传性能方面比较稳定。本研究从曲样中筛选适应力较强、发酵力强、产酒性能良好的酵母，为后续应用于小曲白酒生产的研究奠定基础，对提高原料的出酒率和成品酒的质量稳定性也有一定的积极作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种及主要试剂

成都、泸州等地的10种不同曲样中分离出的18株酵母，编号Y-1～Y-18。试饭对比小曲为市售酒曲。3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2培养基

TTC上层培养基［7］，TTC下层培养基［7］；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）培养基［8］；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基；葡萄糖发酵培养基；20°Bx大米粉发酵培养基［9］；20°Bx高粱发酵培养［9］。

1.2仪器与设备

MYT型糖度仪：上海沪粤明科技仪器有限公司；Super Alcomat型酒精度测定仪：北京桑翌实验仪器研究所；UV-200型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯有限公司；LHR型智能生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；BS-2F型数控恒温摇床培养箱：常州精成国华仪器有限公司；MLS-3020型全自动高压灭菌锅：日本三洋公司。

1.3试验方法

1.3.1产酒酵母的初筛

将从6种曲样中分离纯化的酵母菌株接种至TTC下层培养基上，30℃条件下倒置培养48 h后倒入TTC上层培养基，保温2 h观察菌落颜色深浅。

1.3.2产酒酵母的复筛

将经TTC初筛获得的酵母菌接种到YEPD培养基中30℃、110 r/min培养24 h。取活化菌液计数调整菌悬液中酵母细胞数为108CFU/mL，按10%的接种量分别接种于高粱发酵培养基、葡萄糖发酵培养基、大米粉发酵培养基中，于30℃静置发酵。每隔12 h振荡称质量并记录CO2失重，直到12 h的CO2失重＜0.2 g时停止发酵，每株菌设计3个平行对照组，筛选出最适发酵培养基和CO2失重较好的产酒酵母进行三级筛选。

1.3.3产酒酵母的三级筛选

将复筛获得的产酒酵母接种到YEPD培养基中110 r/min、30℃培养24 h，取活化菌液计调整菌悬液中酵母细胞数为108CFU/mL，10%的接种量接种至1.3.2中筛选出的最适发酵培养基中，30℃条件下静置发酵84 h，发酵结束后采用DNS法测定样液中的残糖［10-11］，比重法测定100 mL蒸馏样液中的酒精度，每株菌设计3个平行对照组。

1.3.4产酒酵母的鉴定

将筛得的酵母送往上海杰李生物技术有限公司进行鉴定。

1.3.5酵母曲与根霉曲的复配试饭

将筛选出的优良产酒酵母制作成纯种酵母曲［12］，并和根霉曲进行复配，复配方案如表1所示。将复配好的曲接入60 g蒸熟的大米中，于30℃条件下培养箱中培养48 h后取出，用DNS法测定其试饭糖分，滴定法测定酸度［13］，比重法测定蒸馏液的酒精度，每组做3个平行，并与市售小曲进行对比。

表1　酵母曲与根霉曲复配方案Table 1 The compound plans of yeastQuandRhizopus Qu

2　结果与分析

2.1产酒酵母的初筛

TTC可与酵母的代谢产物产生显色反应，酵母的产酒精能力越强则与TTC反应后菌落的呈色越深，利用TTC培养基对18株酵母进行初筛，显色结果如图1所示。由图1可知，颜色较深（较红）的7株酵母菌株编号分别为Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18，将经过TTC平板筛选得到的酵母做进一步复筛。

图1　TTC与酵母显色结果Fig.1 The chromogenic results of TTC and yeast

2.2产酒酵母的复筛

发酵周期和发酵速度是考察酿酒酵母发酵性能的重要指标，酵母菌利用可发酵性糖，生成乙醇和二氧化碳，因此可利用发酵过程中发酵液减少的二氧化碳量来衡量酵母的发酵性能［14］。将7株菌Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18制成菌悬液，稀释至细胞数为108CFU/mL，按10%的量接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶中，每株菌设计3个平行对照组，每12 h观察产气情况及质量变化情况，结果见图2。

由图2可知，筛选菌种在相同条件下经84 h发酵后，大米粉发酵培养基的CO2失重整体高于葡萄糖发酵培养基和高粱发酵培养基；在3种发酵培养基中，7株酵母起酵速度都比较快，其中Y-16、Y-17和Y-18的累积CO2失重都在较高水平，最高在9.95～10.77 g，发酵速度上也优于其他菌，各项指标都较为稳定，随培养基的变化波动较小。综合以上分析，Y-16、Y-17和Y-18的发酵性能较好且相对稳定，故选用菌株Y-16、Y-17和Y-18进行三级筛选。

图2　产酒酵母复筛CO2失重结果Fig.2 CO2weight loss results ofBaijiu-making yeast in the secondary screening

2.3产酒酵母的三级筛选

将Y-16、Y-17、Y-18三株菌接种于大米粉发酵培养基中，30℃静置发酵84 h检测其酒精度与残糖指标，结果如图3所示。

图3　产酒酵母三级筛选的残糖及酒精度比较Fig.3 Comparison of residual sugar and alcohol content of the Baijiu-making yeast tertiary screening

酵母发酵消耗糖生成酒精，残糖量越低则酒精度越高。由图3可知，3株菌的发酵性能良好，经过84 h发酵后酒精度均＞8.8%vol，残糖量均在＜1.8 g/100 mL；菌株Y-18在糖度为20°Bx的发酵液中有较好的发酵特性，残糖量较菌株Y-16和菌株Y-17低，还原糖利用率高，发酵比较彻底，产酒精能力也相对于其他两株菌较强，其残糖量和酒精度分别为0.69 g/100 mL和10.3%vol。

2.4产酒酵母的鉴定［15］

利用ITS1和ITS4一对引物对菌株Y-18的rDNA-ITS序列进行PCR扩增，并对扩增序列测序，用BLAST将测序结果与GenBank数据库中的序列进行比较并构建系统发育树，结果见图4。由图4可知，Y-18与Saccharomyces cerevisiae SCPW 17聚在一簇的相似度为100%，表明其很可能属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的一个种。

图4　菌株Y-18的rDNA-ITS序列与其他近缘种的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y-18's rDNA-ITS sequence and other relative species

2.5纯种酵母与根霉的复配曲试饭试验

试饭试验是检验小曲质量的有效方法，通过分析试饭后蒸馏液的酸度、酒精度及残糖可以在一定程度上反应出小曲在实际生产中的情况。本试验利用菌株Y-18的纯种曲与实验室筛选的一株优良根霉制作的根霉曲进行复配，并与市售小曲进行试饭试验对比，其结果如图5所示。

图5　不同复配方案的试饭结果Fig.5 The rice-testing results of different compound plans

由图5可知，酵母菌和根霉在生长上存在一定的相互影响；根霉曲的量多有利于前期的糖化过程，使得曲的糖化力增强，可为酵母发酵产酒提供更多的糖，酵母曲有利于后期的产酒，随着酵母曲量的增加试饭的酒精度也随之升高，酸度也有一定增加；在所考察的复配方案中，A10的试饭糖分最低、酸度适中、酒精度最高，其酒精度为7.24%vol。而对比市售小曲酒精度为2.34%vol，还原糖的含量比较高，说明对比小曲的发酵速度明显慢于实验组。因此就48 h内复配曲试饭的整体效果来看，试验组要好于对比市售小曲，该试验组菌种配比可作为小曲制作的参考配比。

3　结论

经TTC显色试验、产气实验、和发酵实验，从18株酵母中筛选出一株优良的产酒酵母Y-18，其菌落与TTC显色后呈深红，在大米粉发酵培养基中静置发酵84 h后的CO2失重为10.77 g、酒精度为10.3%vol、残糖为0.69 g/100 mL，经分子鉴定确定其为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），将该菌株制作成纯种的酵母曲并和根霉曲进行复配研究，试饭结果表明，复配方案A10的试饭效果最佳，其糖度为4.63%、酸度为9.5 g/100 mL、酒精度为7.24%vol，可作为利用该菌株生产小曲的参考依据，因此，酵母菌Y-18作为生产小曲的菌种具有较好的应用价值。

［1］沈怡方.白酒生产技术全书［M］.北京：中国轻工业出版社，1998.

［2］李一川.高质量小曲白酒的研究［D］.武汉：湖北大学硕士论文，2014.

［3］李锐利.高产乙酸乙酯酵母的选育及在清香型小曲酒中的应用研究［D］.武汉：湖北工业大学硕士论文，2011.

［4］邓开野，林佩芳，黎尔纳.甜酒曲中产糖化酶根霉菌株紫外诱变选育［J］.食品科学，2012，33（7）：204-208.

［5］张翠英，张艳英，齐亚楠，等.低产高级醇酿酒酵母工程菌株在小曲酒酿造中的应用［J］.酿酒科技，2013（7）：62-64.

［6］王鹏.提高小曲微生物发酵性能的研究［D］.南昌：江西农业大学硕士论文，2014.

［7］郜希璐.白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究［D］.天津：天津大学硕士论文，2009.

［8］KREGER V R N J W.The yeasts：a taxonomic study［M］.Netherlands：Elsevier Science Publishers B.V.，1984.

［9］贺小贤，常海山，丁勇，等.陕西稠酒小曲中高产酒精酵母的筛选和鉴定［J］.食品科技，2011，36（3）：10-13.

［10］王春晓，江璐，刘延琳.DNS法监控葡萄酒发酵进程的应用研究［J］.中国酿造，2012，31（9）：24-27.

［11］许鹏，贾士儒，谭之磊，等.发状念珠藻多糖和细胞培养液对葡萄糖浓度测定的影响［J］.中国酿造，2009，28（5）：144-146.

［12］肖冬光，赵树欣，陈叶福，等.白酒生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2011.

［13］王福荣.酿酒分析与检测［M］.北京：化学工业出版社，2012.

［14］孙神英.不同酵母菌对白酒风味成分的影响［D］.武汉：武汉轻工大学硕士论文，2014.

［15］褚学英，惠丰立，李晓辉.大曲中主要酵母菌的分子鉴定［J］.中国酿造，2008，27（5）：27-29.

Screening and identification ofBaijiu（liquor）-making yeast and its application in Xiaoqu

BIAN Minghong1，2，WAN Shilv1，2，DAI Mei1，LI Xiaobing3
（1.School of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Sichuan University of Science&Engineering，Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Zigong 643000，China；3.State-owned Huangmu Forest Farm of Hanyuan，Ya'an 625000，China）

Using 18 strains yeast separated from 10 kinds ofBaijiu（liquor）starter samples of Sichuan southwest area as research object and using alcohol-producing ability as main indicator，a dominate strain，Baijiu-making yeast Y-18 was obtained by tertiary screening，and it was identified asSaccharomyces cerevisiaeby molecular identification.The yeast was made into purebred yeastQuand mixed withRhizopus Quto carry out the rice-testing experiments.The results indicated that in rice fermentation medium，the residual sugar content of yeast Y-18 was the lowest（0.69 g/100 ml）and the alcohol content was the highest（10.3%vol）.When the yeastQuaddition was 1.8 g andRhizopus Quaddition was 0.5 g in the 60 g steamed rice，the rice-testing had the highest alcohol content（7.24%vol），moderate acidity and the lowest residual sugar.

Baijiu（liquor）-making yeast；screening；identification；Xiaoqu；application

TS261.11

0254-5071（2016）03-0057-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.013

2015-12-15

酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开发基金项目（NJ2013-03）

边名鸿（1979-），女，副教授，硕士，研究方向为发酵工程。