彭胜男，陈　亮，苏小军，3，周红丽*

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省核农学与航天育种研究所，湖南 长沙 410125；3.生物质醇类燃料湖南省工程实验室，湖南 长沙 410128）

氨水协同60Co-γ射线辐照预处理促进芒草酶解糖化的研究

彭胜男1，陈亮2，苏小军1，3，周红丽1*

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省核农学与航天育种研究所，湖南 长沙 410125；3.生物质醇类燃料湖南省工程实验室，湖南 长沙 410128）

以经400 kGy60Co-γ射线辐照处理过的芒草为原料，采用氨水室温下浸泡对其进行协同预处理，考察氨水体积分数、固液比及浸泡时间对芒草化学组分和酶解糖化效果的影响，并设计正交试验优化了氨水协同60Co-γ射线辐照预处理芒草的工艺。结果表明，在固液比为1∶10（g∶mL）条件下，经10%（V/V）氨水浸泡48 h的辐照芒草酶解后，还原糖含量达到471.74 mg/g。

氨水；辐照；芒草；酶解糖化

能源作为国家发展和国民经济的支柱，其重要性不言而喻，而随着时代的进步和人口的增长、传统化石能源日益短缺，亟需寻找一种资源丰富、价格低廉的新型能源来代替传统的化石能源以支持人类的进步和发展［1-2］。如今对新型能源的研究多种多样，而以木质纤维素类植物如芒草、玉米秸秆、芦苇等为原料生产燃料乙醇正是目前的研究热点［3］。预处理是木质纤维素类原料转化为燃料乙醇的重要工艺环节。目前有物理、化学、生物3种类型的预处理方法，辐照预处理通常被归为物理预处理，是一种绿色无污染的有效预处理手段。木质纤维素在高剂量辐照条件下纤维素聚合度下降，结构松散，酶解反应的酶解效率显著提高［4-6］。

单纯辐照处理所需剂量大，而低剂量辐照的纤维素降解效果不理想［7］。前期研究表明低剂量辐照与其他预处理的方法结合使用可使酶解糖化效果更佳［8］。彭姿等［9］研究了稀硫酸结合低剂量辐照能节省成本并大幅度提高原料的酶解效率。氨水是种价格相对低廉的弱碱，经稀释还可作为农业用的肥料，对环境影响相对较小，其对纤维素及半纤维素破坏较小，并能去除原料中所含对发酵不利的乙酞基，不会产生对后续发酵不利的副产物［10］。

本实验以纤维素和半纤维含量高的芒草［11-12］为原料，以降低预处理成本为目的，研究了室温下氨水对较低剂量辐照芒草的协同处理效果，优化了氨水协同辐照处理芒草的工艺，以期能为建立氨水协同辐照预处理芒草酶醇糖化的技术体系提供数据支撑，为辐照预处理木质纤维素的大规模商业应用提供技术参考和理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

芒草：湖南农业大学教学科研基地提供。将采集的芒草烘干，于室温条件下经60Co-γ射线以辐照剂量率为2 kGy/h进行辐照处理，辐照200 h后得到400 kGy60Co-γ射线辐照处理芒草（以下简称辐照处理芒草），未辐照的芒草剪成长5 cm左右备用。

氨水、亚氯酸钠、冰醋酸、丙酮、硫酸、硝酸、乙醇、醋酸钠、3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、四水合酒石酸钾钠、苯酚、葡萄糖、纤维素酶（5 000 U/mL）：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Fz102微型植物粉碎机：天津市泰娇特仪器有限公司；DZKW-56光明电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；DGH-9246A电热恒温鼓风干燥箱、LD5-2A低速离心机：上海精密试验设备有限公司；277547纤维素测定仪：意大利VELP Scientifica公司；ZHWY-2012C恒温培养振荡器：上海天域分析仪器制造有限公司；R0704135可见分光光度计：上海尤尼柯试验有限公司。

1.3试验方法

将经处理后的辐照及未辐照芒草材料进行粉碎，放入密封袋中保存，同时制备经不同氨水浓度、浸泡时间、固液比处理的辐照芒草样品。测定不同样品的综纤维素、纤维素、半纤维素及木质素含量，制备不同样品的酶解液，测定其还原糖含量。再根据单因素试验结果对辐照芒草进行氨水预处理条件优化正交试验。

酶解液的制备：取1 g待测样品，置于50 mL锥形瓶中，加入600 U/g纤维素酶及pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使得最后的酶解固液比为1∶10（g∶mL）。每个单因素做3个平行。置于温度50℃、转速120 r/min的摇床中，酶解96 h后，置于沸水浴5 min使酶失活，待酶解液冷却后定容、离心，取上清液备测。

1.3.1不同预处理方法对芒草基本成分和酶解糖化效果的影响

配制体积分数为10%的氨水溶液500 mL。分别于2个500 mL锥形瓶中装入25 g辐照、未辐照芒草，再分别加入250 mL 10%的氨水溶液，浸泡24 h，过滤洗涤至中性，收集残渣，放入65℃烘箱干燥18 h后，得到经10%氨水处理的辐照及未辐照芒草，并与未经处理的辐照及未辐照芒草测定综纤维素、纤维素、半纤维素和木质素含量。酶解糖化，以还原糖含量评定不同预处理方法对芒草基本成分和酶解糖化效果的影响。

1.3.2不同体积分数的氨水溶液对辐照芒草酶解糖化效果的影响

分别配制体积分数为0、5%、10%、15%、20%氨水溶液各500 mL。分别装入5个1 L的锥形瓶中，再分别加入50 g经辐照处理的芒草，每个处理重复3次。密封后于室温（25℃）条件下浸泡24 h，过滤洗涤至中性，收集残渣，部分放入65℃烘箱干燥18 h，用于测定综纤维素、纤维素、半纤维素和木质素含量。未烘干部分先测定水分含量，再用于酶解糖化，以还原糖含量评定氨水预处理的效果。

1.3.3不同固液比浸泡对辐照芒草酶解糖化效果的影响

取5个1 L锥形瓶，装入50 g经辐照处理的芒草，分别以固液比1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL）加入体积分数为10%氨水，密封后于室温（25℃）条件下下浸泡24 h，每个处理重复3次。过滤、洗涤、收集固体残渣，部分放入65℃烘箱干燥18 h，用于测定综纤维素、纤维素、半纤维素和木质素含量。未烘干部分先测定水分含量，再用于酶解糖化，以还原糖含量评定氨水预处理的效果。

1.3.4不同浸泡时间对辐照芒草酶解糖化效果的影响

取5份50 g经辐照的芒草样品置于1 L锥形瓶中，各加入体积分数为10%氨水500 mL，密封后置于室温（25℃）条件下分别浸泡0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，过滤、洗涤至中性、收集残渣，放入65℃烘箱干燥18 h，用于测定综纤维素、纤维素、半纤维素和木质素含量的测定。未烘干部分先测定水分含量，再用于酶解糖化，以还原糖含量评定氨水预处理的效果。

1.3.5正交试验

在确定氨水体积分数、浸泡时间及固液比对400 kGy60Co-γ射线辐照芒草酶解糖化影响的基础上，以还原糖含量为评价指标，设计出如表1所示的正交试验因素与水平，以寻求最佳氨水预处理条件。

表1　氨水预处理条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for ammonia water pretreatment conditions optimization

1.3.6分析测定

综纤维素的含量的测定按照国标GB/T 2677.10－1995《造纸原料综纤维素含量的测定》中的方法进行；纤维素的含量的测定采用硝酸—乙醇法［13］；木质素的含量的测定按照国标GB/T 2677.8－94《造纸原料酸不溶木素含量的测定》中的方法进行；纤维素酶活测定按照轻工行业标准QB 2583—2003《纤维素酶制剂》中滤纸酶活力测定方法测定；半纤维素含量=综纤维素含量－纤维素含量。

还原糖的测定采用3，5-二硝基水杨酸法。葡萄糖标准曲线制备：准确称取1.000 g经（103±2）℃恒质量的葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配制为质量浓度为10g/L葡萄糖标准溶液。分别取该葡萄糖标准溶液0.05mL、0.10mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL各3管于25 mL具塞比色管中，再分别加入蒸馏水0.45mL、0.40mL、0.35mL、0.30 mL、0.25 mL、0.20 mL、0.15 mL，加一支空白管，空白管内加入0.5 mL蒸馏水，共22支比色管各加1.5 mL pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后再各加入3 mL DNS试剂，继续混匀，沸水浴10min，迅速冷却至室温并定容至刻度、摇匀。以空白管为对照，在波长540 nm处测定各管的吸光度值。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线的建立

以葡萄糖标准溶液的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.073 0x+ 0.025 3，相关系数R2为0.999 21，表明二者线性关系良好。

2.2不同预处理方法对芒草基本成分和酶解糖化效果的影响

表2　不同预处理方法对芒草基本成分和其酶解液还原糖含量的影响Table 2 Effect of different pretreatment methods onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

由表2可知，经辐照或是经10%氨水浸泡处理后的芒草，综纤维素含量均有下降，但幅度都不大，木质素含量基本保持不变，表明辐照或氨水浸泡处理降解木质素的能力不明显。辐照处理的芒草酶解后还原糖含量由11.271 mg/g升高至31.965 mg/g，提高了近2倍，氨水浸泡未辐照的芒草酶解后还原糖含量由11.271 mg/g升高至69.026 mg/g，提高了近5倍，说明辐照预处理和氨水浸泡对芒草的酶解糖化促进作用效果都很明显，而经10%氨水浸泡的辐照芒草酶解后还原糖含量达到399.575 mg/g，说明氨水浸泡对辐照预处理芒草的酶解糖化有显著的协同作用。

2.3不同体积分数的氨水溶液对芒草基本成分和酶解糖化效果的影响

由表3可知，随着氨水体积分数对芒草棕纤维、纤维素及半纤维素含量影响都不大，而随氨水体积分数升高，木质素含量有所下降，说明氨水能选择性脱除木质素。可能是因为氨水体积分数升高，引起了综纤维的进一步被部分分解破坏，导致还原糖得率减少［15］。氨水体积分数由0升高至20%，辐照芒草酶解后还原糖含量依次增大，从0到10%的增加幅度最大。当氨水溶液体积分数继续由10%升至20%，还原糖含量增加的幅度减小。10%与15%之间综纤维与木质素差别不大，因此体积分数为10%氨水溶液为辐照芒草糖化前预处理的较优选择。

表3　氨水体积分数对芒草基本成分和其酶解液还原糖含量的影响Table 3 Effect of ammonia concentration onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

2.4固液比对辐照芒草基本成分及酶解糖化效果的影响

表4　固液比对芒草基本成分和其酶解液还原糖含量的影响Table 4 Effect of solid-liquid ratio onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

由表4可知，在固液比从1∶1（g∶mL）升至1∶20（g∶mL）的过程中，酶解后还原糖含量的变化先升高后下降。固液比从1∶1（g∶mL）升至1∶10（g∶mL），还原糖含量增长明显，固液比＞1∶10（g∶mL），还原糖含量有所下降。而综纤维素、纤维素及半纤维素含量均保持微小幅度增长，不溶木素含量基本保持不变。因此，采用10%氨水浸泡辐照芒草固液比以1∶10（g∶mL）比较合适。

2.5不同浸泡时间对辐照芒草酶解糖化效果的影响

由表5可知，处理时间在0～60 h范围内，还原糖含量随时间增加而升高，浸泡48 h和60 h的差别不大，而后随着浸泡时间继续增加，还原糖含量降低。0～72 h综纤维素、纤维素含量变化不大，而半纤维素和木质素含量逐渐减少，72 h时出现反现象。这可能是由于随着浸泡时间增长，木质素被脱除得越多，使得纤维素暴露得越多，酶解效果就越明显。但浸泡时间过长，会产生糠醛、酮类等物质，它们对酶解反应有抑制作用，影响还原糖的转化［15］。而浸泡时间过长在实际生产中影响经济效益，因此，认为氨水浸泡处理辐照芒草时间以48 h为宜。

表5　浸泡时间对芒草基本成分和其酶解液还原糖含量的影响Table 5 Effect of soaking time onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

2.6正交试验结果

在单因素试验基础上，选取浸泡时间（A）、氨水体积分数（B）及固液比（C）为影响因素，还原糖含量为考察指标，进行3因素3水平正交试验，结果与分析见表6，正交试验结果方差分析见表7。

表6　氨水预处理条件优化正交试验结果与分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for ammonia water pretreatment conditions optimization

由表6可知，对还原糖含量结果影响顺序为氨水体积分数＞固液比＞浸泡时间，根据k值大小选择得到氨水预处理条件优化最佳条件组合为A2B2C2，即浸泡时间为36 h，氨水体积分数10%，固液比为1∶10（g∶mL）。在此最佳条件下，还原糖含量为471.735 mg/g。

表7　正交试验结果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表7可知，氨水体积分数对试验结果有显著影响（P＜0.05），浸泡时间及固液比对试验结果没有显著性影响。

3　结论

本试验确定了氨水协同辐照预处理能显著提高芒草酶解效率，最优氨水预处理条件：10%氨水以1∶10（g∶mL）的浸泡固液比，浸泡48 h，酶解还原糖含量达到471.735 mg/g。本试验所用的氨水能有效提高酶解效率，且价格相对低廉，经稀释还可作为农业用的肥料，对环境影响较小。本研究提供了氨水协同辐照预处理的最优工艺，对于辐照协同其他方法预处理纤维素材料提供了理论依据和研究基础，对于协同预处理具有一定的指导意义。

［1］CEOTTO E.Grasslands for bioenergy production，a review［J］.Agron Sust Dev，2008，28（4）：47-55.

［2］苏小军，熊兴耀，谭兴和，等.燃料乙醇发酵技术研究进展［J］.湖南农业大学学报：自然科学版，2007，33（4）：480-485.

［3］WANG B，WANG X，FENG H.Deconstructing recalcitrantMiscanthus with alkaline peroxide and electrolyzed water［J］.Bioresource Technol，2010，101（2）：752-760.

［4］李春光，董令叶，吉洋洋，等.花生壳纤维素提取及半纤维素与木质素脱除工艺探讨［J］.中国农学通报，2010，26（22）：350-354.

［5］RAGAUAKAS A J，WILLIAMS C K，DAVISION B H，et al.The path forward for biofuels and biomaterials［J］.Science，2006，311（5760）：484-489.

［6］BAK J S，KO J K，HAN Y H，et al.Improved enzymatic hydrolysis yield of rice straw using electron beam irradiation pretreatment［J］.Bioresource Technol，2009，100（3）：1285-1290.

［7］张木明，徐振林，张兴秀，等.预处理对稻草秸秆纤维素酶解产糖及纤维素木质素含量的影响［J］.农产品加工·学刊，2006（3）：4-6.

［8］彭姿，谭兴和，熊兴耀，等.NaOH处理提高辐照芒草木质纤维素酶解效率的研究［J］.中国农学通报，2014，30（14）：185-191.

［9］彭姿，谭兴和，熊兴耀，等.稀硫酸处理促进辐照芒草木质纤维素酶解糖化条件的优化［J］.安徽农业科学，2013，41（31）：12455-12457，12461.

［10］陈静萍，王克勤，彭伟正，等.60Co-γ射线处理稻草秸秆对其纤维素酶解效果的影响［J］.激光生物学报，2008，17（1）：39-42.

［11］胡春婷，杨丹青，张婷婷，等.辐照-纤维素酶糖化降解芒草工艺条件优化研究［J］.中国酿造，2011，30（2）：29-32.

［12］VRIJE T D，BAKKER R R，BUDDE M A W，et al.Efficient hydrogen production from the lignocellulosic energy cropMiscanthusby the extreme thermophilic bacteriaCaldicellulosiruptor saccharolyticusand Thermotoga neapolitana［J］.Biotechnol Biofuel，2009，4（2）：12-17.

［13］王林风，程远超.硝酸乙醇法测定纤维素含量［J］.化学研究，2011，22（4）：52-55.

［14］徐忠，汪群慧，姜兆华.氨预处理对大豆秸秆纤维素酶解产糖影响的研究［J］.高校化学工程学报，2004，18（6）：773-776.

［15］SCHELL D，NGU Y Q，TUCKER M，et al.Pretreatment of softwood by acid-catalyzed steam explosion followed by alkali extraction［J］.Appl Biochem Biotech，1998，72（1）：17-24.

Enhance enzymatic saccharification ofMiscanthus sinensisby synergic pretreatment with60Co-γ ray irradiation and ammonia water

PENG Shengnan1，CHEN liang2，SU Xiaojun1，3，ZHOU Hongli1*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science&Space Mutation Breeding，Changsha 410125，China；3.Hunan Engineering Laboratory for Alcohol Fuels from Biomass，Changsha 410128，China）

Miscanthus sinensiswas irradiated by 400 kGy60Co-γ ray，and then was soaked in ammonia water at room temperature.The effects of ammonia water concentration，solid-liquid ratio and soak time onM.sinensischemical constituents and enzymolysis saccharification were investigated. The conditions ofM.sinensissynergic pretreatment with60Co-γ ray irradiation and ammonia water were optimized by orthogonal experiments.The results showed that under the conditions of solid-liquid ratio 1∶10（g∶ml），M.sinensisirradiated was soaked in 10%（V/V）ammonia water for 48 h，and the reducing sugar content was 471.74 mg/g.

ammonia water；irradiation；Miscanthus sinensis；enzymatic saccharification

S543.9

0254-5071（2016）03-0023-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.006

2015-12-12

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2007AA10Z320）

彭胜男（1990-），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程和生物质能源。

周红丽（1972-），女，副教授，博士，研究方向为农副产品综合利用、发酵食品研究与开发。