杨洋　王树玉　周丽颖　白万凯

[摘要]目的：运用基于8位点的PCR-荧光探针法检测人Y染色体AZF区微缺失情况，分析其结果的可靠性并探讨其对严重少精或无精症患者的临床意义。方法：随机抽取150例严重少精或无精子症患者的外周血，分别运用PCR-荧光探针法和多重PCR凝胶电泳法进行检测Y染色体微缺失AZFa、AZFb、AZFc和AZFd区共8个位点，统计其缺失情况，并分析两方法检验结果的一致性。结果：Y染色体微缺失总发生率为6.00%，非梗阻性无精子症组为9.26%；严重少精子症组为4.17%，PCR-荧光探针法和PCR-电泳法检测结果完全一致。结论：Y染色体AZF区与精子生成关系密切，严重少精子症或非梗阻性无精子症男性行辅助生殖技术前应筛查其微缺失情况；PCR-荧光探针法检测人Y染色体AZF区微缺失稳定快捷，结果可靠。

[关键词]荧光定量PCR；Y染色体微缺失；男性不育

[中图分类号]R698+.2 [文献标志码]A

已婚孕龄夫妇中不孕不育症的发病率约为15%，其中男性因素约占50%。由遗传缺陷引起的精子发育障碍约占男性不育的30%以上，而Klinefelter综合征与Y染色体微缺失是最主要的遗传性因素。2015年我国男性生殖遗传学检查专家共识中指出，非梗阻性无精子症及严重少精子症患者，建议进行Y染色体微缺失检测（包括AZFa、AZFb、AZFc和AZFd区共8个位点），这对男性生殖遗传学临床治疗、提高辅助生殖技术的疗效和安全性以及开展胚胎植入前遗传学诊断（PGD）等具有重要意义。

目前，Y染色体微缺失的检测方法主要在PCR技术的基础上展开。国内临床实验室多依据欧洲男科学协会/欧洲分子遗传试验质控协作网提出的方案，采集外周血标本进行多重PCR凝胶电泳检测。该技术耗时长、存在操作污染风险、结果判定主观性较大，不太适应目前临床科室需要。本研究使用PCR-荧光探针法检测150例非梗阻性无精子症和严重少精患者的Y染色体AZF区8个位点的微缺失情况，比较其与传统多重PCR凝胶电泳法所测结果的优劣，并探讨不育男性Y染色体微缺失发生率及其与精子生成的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

连续收集我院生殖门诊无精子症及严重少精子症（浓度<5×10⁶/mL）患者150例，根据WHO人类精液检验与处理实验室手册（2010）检测精液至少2次，无精子症患者精液须离心镜检确诊，并排除Klinefelter综合征、小睾症、梗阻性无精子症、既往睾丸外伤、恶性肿瘤术后放化疗、重度精索静脉曲张及隐睾者。签署知情同意书，采取其外周血并EDTA抗凝。

1.2 实验方法

根据GenBank公布的STS位点的PCR扩增方法，将同一患者的两份外周血标本分别使用基于8位点（包括AZFa、b、c、d区）的PCR-荧光探针法（人Y染色体AZF区微缺失核酸检测试剂盒，北京爱普益生物科技有限公司）与多重PCR凝胶电泳法进行检测。

1.3 统计学方法

两组检测结果进行配对卡方检验及进行一致性检验（Kap-pa检验），分析两种方法检测结果的一致性。设定Kappa值若≥0.75，一致性较好；若<0.40，一致性不理想。

2 结果

2.1 PCR-荧光探针法与PCR凝胶电泳法检测STS缺失一致性分析

使用多重PCR凝胶电泳法与PCR-荧光探针法分别检测150例外周血标本，二者在检出率及检出位点方面完全一致。配对卡方检验显示，与PCR-电泳法比较，PCR-荧光探针法的检测结果二者差异无统计学意义。对检测结果进行一致性检验（Kappa检验），结果显示Y染色体AZF区8个STS位点的P值及Kappa值均为1，差异无统计学意义，即PCR-荧光探针法与PCR-凝胶电泳法检测AZF区微缺失位点无差异，二者一致性好。两组方法检测Y染色体AZF区微缺失符合情况见表1。

2.2 不同组别患者Y染色体微缺失情况分析

150例受试者中，非梗阻性无精子症54例，检出Y染色体微缺失6例：严重少精子症96例，检出4例。其中，1例8位点及SRY全缺失者，之后测得其染色体核型为46，XX。见表2。

3 讨论

1976年Tiepolo等发现了无精子症患者Y染色体长臂的微缺失并提出了无精子症基因（azoospermia factor，AZF）的概念。之后Vogt等在Vq11的远端确定了AZFa、AZFb、AZFc3个区域。1999年Kent等认为在AZFb区与AZFc区之间还存在AZFd区。

AZF的缺失或突变可能导致精子发生障碍，在Yq11区段或更远区段的丢失或这个区段中间的微小缺失均会导致精子发生过程中不同阶段的生精障碍引起少精子症或无精子症，从而导致不育。不育患者中，AZF缺失者约占3%～29%，发生率仅次于Klinefelter综合征，是居于第二位的遗传因素。

常规染色体核型分析无法检测这种Y染色体长臂微缺失。目前通常采用外周血进行淋巴细胞PCR检测，且学术界推荐进行包括AZF4个区域共8个位点的检测，即sY84及sY86、sY127及sY134、sY254及sY255、sY145及sY152。目前研究普遍认为，AZFa区缺失通常导致唯支持细胞综合征（SCOS），睾丸活检不能取得精子，建议供精人工授精（artificial insemination bydonor，AID）。AZFb区或AZFb+c区缺失表现为生精阻滞，患者多为无精子症，建议行AID。单独AZFc区缺失最多见。在严重少精子症或无精子症中，其缺失率可以达到5.9%～11.2%，且临床表现多变，可以为正常精子数目、少精子症或无精子症；据此也有学者认为AZFc区缺失可能是一种多态性表现。对于AZFc区缺失的无精子症患者，可以行睾丸手术取精获得精子行ICSI，不过AZFc微缺失可以遗传给其男性后代。对于AZFc区缺失合并严重少精子症患者，可以ICSI或PGD选择女孩，以避免遗传缺陷的垂直传播。

AZFd区缺失的临床意义尚存争议。有研究报道sY145及sY152可能与精子形态异常相关，其缺失可能导致少精子症或者精子形态异常。临床实际工作发现，按照《WHO人类精液检验与处理实验室手册（2010）》严格形态学标准检测，严重少精子症患者大多同时为畸形精子症。与Mtisltimanoglu研究结果不尽相同，本研究发现，AZFd区sY145并非经常与sY152位点同时缺失，AZFd区缺失多伴AZFb区或AZFc区同时发生：sY145多伴AZFb区缺失，表现为无精子症；而sY152则多伴AZFc区缺失，多表现为无精子症或严重少弱精子症。对于其临床表型特点尚不突出，所以，其机理研究有赖于样本量的提高，以及更多的AZF缺失筛查。

Y染色体微缺失目前常用的检测方法有多重PCR凝胶电泳法、荧光定量PCR法、基因芯片法和荧光原位杂交法等。多重PCR凝胶电泳法作为传统研究方法耗时长、易污染、结果判读较为主观。荧光定量PCR技术在加强临床检验质量控制同时，因其灵敏度、特异性及检测速度等方面的优势，已成为临床实验室的选择趋势。本研究运用荧光定量PCR技术检测效果好，客观快速、结果稳定，也验证了该技术的优势。

我国男性生殖遗传学检查专家共识建议，非梗阻性无精子症和严重少精子症患者应进行AZF染色体微缺失检测：原因不明的男性不育患者可选择性行Y染色体微缺失检测：有相关家族史者，应进行筛查。另外，笔者临床工作中发现数例精子浓度基本正常但筛查染色体为小Y（Y<21）的患者，追查发现其AZFc区缺失，提示某些染色体异常如Y<21者也应筛查Y染色体微缺失。

总之，Y染色体微缺失检测对男性遗传咨询、生殖安全和临床男性不育治疗手段的选择具有重要的意义；荧光定量PCR技术是检测Y染色体微缺失的优选方法。

（收稿日期：2016-02-29）