赵学思,师仁丽,李　岩,于文龙,王向红,*

(1.沧州职业技术学院,河北沧州 061000;2.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)



碱蓬黄酮提取物的体外抗氧化及抑菌性研究

赵学思1,师仁丽2,李岩2,于文龙2,王向红2,*

(1.沧州职业技术学院,河北沧州 061000;2.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)

本研究对不同生长时期的盐地碱蓬中黄酮类化合物进行提取,并对其抗氧化性和抑菌性进行研究。实验采用超声波法提取黄酮类化合物,采用4种不同的方法(还原力,抗脂质过氧化能力,DPPH·,·OH)评价碱蓬黄酮提取物的抗氧化活性,采用牛津杯法测定其抑菌活性。结果表明:展叶期,发芽期,花期的黄酮得率分别为0.728%,0.518%,1.461%。不同生长时期的碱蓬黄酮具有不同的还原能力、清除DPPH·和·OH的活性。不同生长时期内的碱蓬总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用,在花期的总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳,抑菌圈直径分别为19.54 mm和29.46 mm。说明花期的碱蓬总黄酮提取物最适宜作为一种天然的抗氧化剂和抑菌剂而广泛利用。

碱蓬,黄酮类化合物,抗氧化性,抑菌性

碱蓬为藜科(chenopodiaceae)碱蓬属(suaedaforsk.)植物,为一年生叶肉质化真盐生草本植物[1],在5～30 g/kg土壤含盐量生境中有分布[2]。我国共有碱蓬属植物20种,常见种分别为碱蓬(Suaedaglauca(Bge.)Bge.)和盐地碱蓬(Suaedasalsa(L.)Pall),以碱蓬产量最大[3],生于海滨、荒地、田边等含盐碱的土壤中,全株富含碳酸钾,可供工业用。

碱蓬的营养成分丰富,是一种优质的蔬菜和油料作物,保健价值极高[4]。有相关研究报道表明,工业上可用碱蓬籽油来制备共轭亚油酸和硬脂酸,共轭亚油酸由于其具有抗氧化、抗肿瘤、降脂等功效而被广泛应用于医药,同时,碱蓬还能消除裸露盐碱荒滩,防止水土流失,保持和重建盐地生态等[3]。

黄酮类化合物是植物产生的一类次生代谢产物,是一类重要的天然化合物,对人体健康起着重要的作用。大量研究表明黄酮类物质具有降血压、降血脂、增大心脏血流量、增强心脏收缩、减少心脏搏动数、止咳祛痰、抗菌消炎的功效[5]。

碱蓬中黄酮类化合物的研究少见报道。本实验对在不同生长时期内的碱蓬的黄酮类化合物进行了定性和定量的测定,通过测定其还原力,Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸(PUFA)过氧化体系中的抗氧化活性,对DPPH·、·OH的清除活性,评价了碱蓬黄酮类化合物的抗氧化活性,并采用抑菌圈和最低抑菌浓度等实验研究了其抑菌活性。为碱蓬资源的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大肠杆菌(E.coli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中国微生物菌种保藏中心;碱蓬2014年采于河北沧州地区;芦丁对照品(≥99%)中国药品生物制品检验;石油醚(60～90 ℃),无水乙醇,亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠天津市华东试剂厂;邻二氮菲,三氯乙酸天津市天力化学试剂;硫酸亚铁,双氧水北京市中联化工;铁氰化钾天津市福晨化学试剂厂;氯化铁天津市凯通化学试剂有限公司;DPPH北京索莱宝科技有限公司;硫代巴比妥酸国药集团化学试剂有限公司。

BS214D型分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;101-OAB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;万能粉碎机浙江屹立工贸有限公司;UV-2800H型紫外分光光度计尤尼柯仪器有限公司;XMTD-6000型恒温水浴锅北京长风仪表公司;RE-52A型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;QTSX6150型超声波清洗器天津市瑞普电子仪器公司;TGL16M型离心机长沙易达仪器公司;灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂;超净台苏州安泰空气技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1原料预处理将收集到的碱蓬,用清水洗净,置于45 ℃烘箱内烘干,取出后粉碎并过40目筛,备用。

1.2.2碱蓬中黄酮类化合物的提取称取碱蓬样品1 g,置于烧杯中,加10 mL石油醚(60～90 ℃),超声提取30 min,功率200 W,除脂,在水浴下挥干石油醚,加40 mL 70% 甲醇(v/v),浸泡45 min后再超声提取20 min,重复一次,合并提取液,将提取液离心15 min(4500 r/min)。弃去沉淀得到总黄酮提取液,放于50 mL的容量瓶中,定容。

1.3总黄酮含量的测定

1.3.1对照品溶液的配制精密称取芦丁标准品10 mg,溶解在95%的乙醇中,定容至10 mL的容量瓶中,再从中准确量取5 mL,用95%的乙醇稀释定容至50 mL的容量瓶中,得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。

1.3.2标准曲线的绘制采用NaNO3-Al(NO3)3-NaOH比色法[6],精密吸取芦丁标准品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分别置于10 mL容量瓶中,不足5 mL的用95%乙醇补充,加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液,静置6 min;加入0.5 mL的10%的Al(NO3)3溶液,静置6 min;最后加入4%的NaOH溶液4 mL,放置10 min。测定其在510 nm处的吸光度值,以标准品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。

用以上方法测定样品的吸光值,通过标准曲线计算得出样品中总黄酮含量。

1.4还原力的测定

采用孟娜等人的方法[7],取2.0 mL不同浓度的总黄酮溶液,分别加入pH为6.6的0.2 mol/L 磷酸缓冲液2.0 mL及1%铁氰化钾溶液2.0 mL,50 ℃孵育20 min后快速冷却,加入10%三氯乙酸水溶液2.0 mL,于3000 r/min离心10 min,取上清液5.0 mL,加蒸馏水5.0 mL及0.1%三氯化铁水溶液1.0 mL,充分混匀后,在室温下静置10 min,于波长700 nm处测定吸光度。

1.5Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸(PUFA)过氧化体系中的抗氧化活性

按照周媛等人的方法[8],稍作修改,配制浓度分别为10,50,100,200,300,400,500 mg/mL的三个时期的碱蓬黄酮溶液,VC溶液为样品溶液。选用1∶25的卵黄悬液并吸取0.2 mL,加入黄酮溶液0.1,0.2 mL FeSO4溶液和1.5 mL 0.1 mol/L PBS溶液,37 ℃培养15 min。加三氯乙酸(TCA),静置离心后吸取2.0 mL上清液加入硫代巴比妥酸(TBA),放入沸水浴中15 min,冷却后,于532 nm处比色测定吸光度值(A),对照管除不加提取液外,其他试剂相同,所测吸光值为A0,样品及VC和PBS对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率(AOA)根据以下公式计算。

AOA(%)=(A0-A)/A0×100

1.6对DPPH·的清除作用

DPPH·清除率的测定:取2.2所得碱蓬黄酮提取液,真空减压浓缩,经真空冷冻干燥后得到干燥的碱蓬粗提物。准确稀释为10、20、40、60、80、100 μg/mL取2 mL,加入等体积的0.2 mol/L 的DPPH·溶液,混匀。避光放置30 min,在517 nm测定其吸光度Ai。

清除率(%)=(1-Ai-Aj/Ac)×100

式中,Ai:待测液+DPPH;Ac:无水乙醇+DPPH;Aj:待测液+无水乙醇。

1.7对·OH清除率的测定

根据文献[10],修改如下:取不同生长时期的碱蓬黄酮提取物,准确稀释为10、20、40、60、80、100 μg/mL,取1 mL依次向样液中加入2 mL磷酸盐缓冲液,2 mL邻二氮菲,2 mL硫酸亚铁溶液,1 mL 0.1%双氧水,充分混匀后在532 nm处测其吸光度。

清除率(%)=(A0-A1)/(A2-A1)×100

式中,A1:70%乙醇代替样液所测的吸光度;A2:用70%乙醇替代H2O2所测的吸光度值。

1.8抑菌性的测定

1.8.1抑菌能力的测定以平板菌落计数法配制浓度约为0.5×107CFU/mL的菌悬液[11]。

准确吸取菌悬液0.1 mL均匀涂布在平皿上,在平板上等距离放入4个经灭菌的牛津杯,分别加入100 μL碱蓬黄酮提取液,用70%的乙醇做对照。28 ℃恒温培养24 h,用游标卡尺测量抑菌圈直径,并记录,各菌重复3次,结果以mm表示。

1.8.2最低抑菌浓度的测定采用2倍稀释法,将样品溶液分别稀释到0.05,0.0125,0.00625,0.003125,0.00156。在每个牛津杯内加入100 μL碱蓬黄酮提取液,用70%的乙醇做对照。28 ℃恒温培养24 h,用游标卡尺测量抑菌圈直径不同浓度的稀释液,28 ℃恒温培养24 h,观察菌落情况。在没有抑菌圈的最高稀释度提取物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

1.9数据统计分析

每个实验操作重复3次,采用spss19.0软件进行多重比较分析。

2　结果与讨论

2.1标准曲线的测定

以1.3.2的方法进行测定,由图1可得标准曲线的回归方程Y=13.220x+0.0033,相关系数为R2=0.9999。

图1　芦丁溶液的标准曲线Fig.1　Standard curve of rutin

2.2总黄酮含量

图2显示了在不同生长时期内碱蓬总黄酮含量的变化。由图2可知,在不同生长时期,碱蓬的总黄酮含量不同。在整个生长时期内,花期的总黄酮含量远高于发芽期和展叶期,展叶期的总黄酮含量最低,三个生长时期黄酮含量差异极显著(p≤0.01)，展叶期、发芽期、花期黄酮得率分别为0.728%、0.518%、1.461%。

图2　碱蓬总黄酮含量Fig.2　Total flavonoid contents of Suaeda

2.3还原力测定

从图3可以看出,不同生长时期的碱蓬总黄酮具有一定的还原力,随着总黄酮质量浓度的增大,其吸光度也增加。还原力强弱顺序为展叶期>花期>发芽期。

图3　不同浓度碱蓬总黄酮的还原力Fig.3　Reducing power of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.4抗脂质过氧化性

由图4可以看出,所有样品随着浓度的降低,对卵黄脂蛋白过氧化的抑制效果减小,浓度范围在300～500 mg/mL时,花期的总黄酮抑制率大于VC。三个生长时期的碱蓬在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸过氧化体系中的抗氧化活性大小顺序为花期>展叶期>发芽期,但是浓度范围在200 mg/mL时,花期的总黄酮抑制率是最低的。

图4　不同浓度碱蓬总黄酮对过氧化的抑制率Fig.4　The inhibition rate of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.5对DPPH·的清除作用

从图5可以看出,不同生长时期的碱蓬总黄酮提取物对DPPH·均具有一定的清除作用,并且在一定范围内,清除能力随总黄酮质量浓度的增加而增强逐渐增大,超过这个范围后,变化不太明显,甚至有降低的趋势,表明碱蓬总黄酮提取物对DPPH·的清除能力与质量浓度之间存在一定的剂量效应关系。当碱蓬总黄酮提取物的浓度达到60 μg/mL时,各生长时期内的碱蓬总黄酮几乎均达到最大的清除率,对DPPH·的清除作用在花期达到最大,为91.43%,而在展叶期最低,为69.87%,发芽期的清除作用最高为89.36%。

表2　碱蓬总黄酮提取物最低抑菌浓度

注：“+”表示有抑菌圈;“-”表示无抑菌圈。

图5　碱蓬在不同生长时期的总黄酮对DPPH·的清除作用Fig.5　DPPH radical scavenging activity of total flavonoids extract from Suaeda

2.6对·OH的清除作用

从图6可以看出,在一定范围内,碱蓬黄酮提取物对·OH的清除率随黄酮质量浓度的增大而增大。表明碱蓬总黄酮含量与清除作用存在量效关系。当质量浓度为60 μg/mL时,发芽期和花期的碱蓬总黄酮达到最大的清除率,为50.3%和54.46%。而展叶期的碱蓬总黄酮在40 μg/mL时达到最大的清除率,为33.5%。黄酮浓度在10～40 μg/mL范围时,碱蓬在发芽期的总黄酮提取物对·OH的清除作用要大于其在展叶期和花期的清除作用,而浓度范围在40～100 mg/mL时,花期的碱蓬总黄酮提取物对·OH的清除作用大于其在展叶期和发芽期的清除作用。

图6　碱蓬不同生长时期的总黄酮对羟基自由基的清除作用Fig.6　The ·OH radical scavenging ability of total flavonoids extract from Suaeda

2.7抑菌作用的实验结果

2.7.1抑菌能力的测定从表1可以看出,不同生长时期的碱蓬总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较明显的抑制作用,对后者的抑制作用要高于对前者的抑制作用。处在花期的碱蓬总黄酮提取物对大肠杆菌(19.54 mm)和金黄色葡萄球菌(29.46 mm)的抑菌圈直径要大于其在发芽期(13.10 mm,15.27 mm)和展叶期(14.19 mm,14.53 mm)的抑菌圈直径。

表1　不同生长时期碱蓬黄酮提取物(1 mg/mL)对供试菌的抑菌效果

2.7.2最低抑菌浓度的确定由表2可知,同一生长时期内碱蓬总黄酮提取物对不同菌的最低抑菌浓度不同,而不同生长时期的碱蓬总黄酮提取物对同一种菌的最低抑菌浓度也不同。发芽期,展叶期和花期的碱蓬总黄酮提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为0.25、0.25、0.125 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.125、0.125、0.00625 mg/mL。

3　结论

本实验结果表明在花期的碱蓬总黄酮含量要远远大于在发芽期和展叶期,因此,提取碱蓬中的总黄酮的最佳时期为花期。

抗氧化实验证明,不同生长时期内的碱蓬总黄酮有一定的还原力与抗脂质过氧化性,对DPPH·和·OH均具有一定的清除作用。还原力强弱顺序为展叶期>花期>发芽期。三个生长时期的碱蓬在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸过氧化体系中的抗氧化活性大小顺序为花期>展叶期>发芽期,但是浓度范围在200 mg/mL时,花期的总黄酮抑制率是最低的。

不同生长时期内的碱蓬总黄酮对DPPH·的清除效果要大于对·OH的清除效果,这可能是因为不同生长时期的碱蓬所含的黄酮的种类不同。

碱蓬总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用大于对大肠杆菌的抑制作用。

我国碱蓬资源丰富但是利用并不充分。随着科技的进步和对安全因素的考虑,合成抗氧化剂被天然抗氧化剂取代是必不可挡的趋势,因此,开发天然的,安全的,成本低廉的抗氧化剂必然成为今后研究的热点。本研究证明碱蓬是一种具有开发前景的抗氧化剂,同时本实验对植物提取物的开发和植物资源的综合利用提供了新的思路和途径。

[1]彭益全,谢橦,周峰,等. 碱蓬和三角叶滨藜幼苗生长、光合特性对不同盐度的响应[J]. 草业学报,2012,21(6):64-74.

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Antioxidation and antibacterial property of flavonoids compounds extracted fromSuaeda

ZHAO Xue-si1,SHI Ren-li2,LI Yan2,YU Wen-long2,WANG Xiang-hong2，*

(1.Vocational and technical college of Cangzhou,061000,China;2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

In this study,the flavonoid compounds in different growth periods ofSuaedasalsawere extracted,and their antioxidant and antimicrobial were studied. Ultrasonic method was used to extract flavonoids. Four methods(reducing power,resisting lipid peroxidation,eliminating DPPH·,·OH)were used to evaluate the antioxidant activity of flavonoids extracted fromSuaedasalsa.The antibacterial activity was evaluated by Oxford cup method. The results demonstrated that the content of the obtained total flavonoids from Leaf expansion,Germination and Florescence was determined to be 0.728%,0.518%,and 1.461%,respectively.Different growth periods of the alkaline flavonoids had different reduction ability,and activity of removing DPPH· and · OH. The flavonoids of Suaeda in different growth period had a certain of bacteriostatic effect toEscherichiacoli,Staphylococcusaureusbut that of in florescence expansion inhibition capability(19.54 mm,29.46 mm)was the strongest. It indicated that the flavonoids extracted fromSuaedacan be used as a natural antioxidant and antibacterial agent extensively.

Suaeda;flavonoids;antioxidation;antibacterial

2015-11-23

赵学思(1972-),男,本科,讲师,农产品贮藏与加工方向,E-mail:shp14181514@163.com。

王向红(1973-),女,博士,教授,食品营养与安全方向,E-mail:wangxianghong73@sina.com。

河北省科技支撑项目(12277117D)；国家海洋公益性行业科研专项(201205031)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.004