常正姣,韩　萍,刘利娥,许艳丽,蒋永红,王文宁

(郑州大学 公共卫生学院,河南郑州 450001)



杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的优化提取及测定

常正姣,韩萍*,刘利娥,许艳丽,蒋永红,王文宁

(郑州大学 公共卫生学院,河南郑州 450001)

目的:探讨杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的最优提取条件,并比较了不同光照时长对虫草素含量的影响,为其工艺条件的优化和综合利用提供依据。方法:采用单因素结合响应曲面法优化虫草素的水浴提取条件,高效液相色谱法测定虫草素含量。结果:最优水浴提取条件为:浸提时间6.59 h、浸提温度81.9℃、料液比1∶90,此条件下虫草素含量为6.0143mg/g;不同光照时长条件下虫草素含量为3.8988～11.9629mg/g,不同光照时长间差异具有统计学意义(p=0.000)。结论:实验确定了虫草素水浴提取的最优条件,并得出不同光照时长对虫草素含量有显著影响,为进一步优化杂粮蛹虫草菌丝共生体的培养条件提供参考依据。

杂粮蛹虫草菌丝共生体,虫草素,响应面法,高效液相色谱法,光照时长

虫草素是蛹虫草重要生物活性成分之一,具有调节血糖[1]、抑菌[2]、抗肿瘤[3-4]、调节免疫力[5]等作用。目前,虫草素主要由蛹虫草培养物分离提取获得,一般通过菌种选育和培养条件优化来提高虫草素含量。蛹虫草的人工培养受多种条件的影响,如培养基组成、温度、光照、pH等的影响,其中光照时长是影响蛹虫草生长发育的一个重要因素。已有研究表明,适宜的光照时长可提高蛹虫草菌丝体对基质的利用率和促进菌丝体的转色及生长,并可促进腺苷和虫草素的合成[6-8]。

以麦仁、糙米、大豆、奶粉为固体杂粮培养基培养蛹虫草真菌,得到被蛹虫草真菌生态转化的杂粮培养基和菌丝体共存的结构整体,即为杂粮蛹虫草菌丝共生体。本实验以不同光照时长下杂粮蛹虫草菌丝共生体为研究对象,采用单因素结合响应曲面法优化虫草素水浴提取条件,并用高效液相色谱法测定共生体中虫草素含量,比较不同光照时长对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素含量的影响,为杂粮蛹虫草菌丝共生体的培养条件优化和其综合利用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

杂粮蛹虫草菌丝共生体样品10份:各样品是蛹虫草CM-3菌种以杂粮为固体培养基经转色后分别培养1、3、5、7、9、11、19、27、35、43 d条件下得到的杂粮蛹虫草菌丝共生体。样品烘干后,使用高速万能粉碎机粉碎,过80目筛备用。

虫草素标准品(HPLC≥98%)上海源叶生物科技有限公司;甲醇(色谱纯)天津四友精细化学品有限公司;乙腈(色谱纯)天津四友精细化学品有限公司;异丙醇(分析纯)天津市富宇精细化工有限公司。

Waters e2695高效液相色谱仪配Waters 2489紫外检测器及Empower 3数据处理系统Waters公司;HH-42型数显恒温搅拌水箱常州国华电器有限公司;TD24-WS型台式低速离心机湖南湘仪实验仪器开发有限公司;AL204电子天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司;MILLI-Q超纯水系统美国Millipore公司。

1.2实验方法

1.2.1液相色谱条件色谱柱:C18柱,ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:V(甲醇)∶V(水)=15∶85;流速:1.0 mL/min,波长:259 nm;进样量:10 μL;柱温:30℃;

1.2.2标准曲线准确称取虫草素标准品1 mg(精确至0.0001 g),用水溶解后定容至10 mL,摇匀,配置成虫草素标准品母液(100 μg/mL)。分别准确吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2、5 mL母液于10 mL容量瓶中,加水定容摇匀,配制成浓度分别为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL的标准溶液。根据色谱条件进行测定,以虫草素浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,计算得出标准曲线和线性回归方程。

1.2.3杂粮蛹虫草菌丝共生体样品处理准确称取样品0.1 g(精确至0.0001 g)于10 mL离心管中,加入一定料液比的超纯水,至于一定温度下的恒温水浴箱中提取一定时间。取出离心(4000 r/min,10 min)后,将上清液定容至10 mL,取1.5 mL过0.45 μm微孔滤膜,供上机分析。

1.3响应面优化水浴提取虫草素的实验设计

1.3.1单因素实验本实验主要考察水浴提取方法中的浸提时间、浸提温度和料液比对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素含量的影响。

浸提时间:固定浸提温度为60℃,料液比为1∶15,浸提时间选择2、4、6、8、10 h五个水平,按照1.2.3进行实验,记录各水平的峰面积。

浸提温度:固定浸提时间为6 h,料液比为1∶50,浸提温度分别选择50、60、70、80、90℃五个水平,按照1.2.3进行实验,记录各水平的峰面积。

料液比:固定浸提温度为60℃,浸提时间为6 h,料液比选择1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90五个水平,按照1.2.3进行实验,记录各水平的峰面积。

1.3.2响应曲面法实验使用Design-Expert8.0软件,根据单因素实验结果结合Box-Behnken实验设计得出不同的虫草素提取条件,按照1.2.3所述方法进行实验。将实验数据进行统计学分析后,得出虫草素对于浸提时间、浸提温度和料液比的回归模型及最优提取条件,并进行验证。Box-Behnken实验因素水平和编码见表1所列。

表1　Box-Behnken实验各变量的编码水平

1.4方法学考察

精密度实验:选取任一样品,在选定色谱条件下连续进样测定6次,测其峰面积计算RSD。

加标回收率实验:选取6个样品,按样品处理方法进行处理,再加入虫草素标准品50 μg,后上机测定,计算加标回收率。

日内稳定性实验:选取任一样品分别于0、2、4、8、12、24 h时进样分析,测其峰面积计算RSD。

日间稳定性实验:选取任一样品分别于1、2、3、4、6、8 d时进样分析,测其峰面积计算RSD。

1.5统计分析

运用Microsoft Excel、SPSS 17.0软件和Design Expert 8.0软件对实验数据进行统计学分析,检验水准α=0.05。

图1　虫草素含量标准曲线Fig.1　Standard curve of cordycepin注:从低到高依次为浓度是1、2、5、10、20、 50、100 μg/mL的虫草素标准品的色谱图。

2　结果与分析

2.1虫草素标准曲线和线性范围考察

虫草素标准曲线如图1,得到回归方程:y=16799.5169x-4683.3499,其中x为虫草素浓度(μg/mL),y为峰面积(106),R2=0.9996,结果表明,虫草素标准溶液在0～100 μg/mL范围内,浓度与峰面积线性关系良好。虫草素标准品高效液相色谱图见图2。

图2　虫草素标准品HPLC重叠色谱图Fig.2　HPLC overlapping chromatogram of cordycepin standard

2.2单因素实验结果

2.2.1浸提时间对虫草素含量的影响结果如图3所示,在其他条件一定时,浸提时间4～6 h对虫草素含量影响很大,呈明显增加趋势;当达到6 h时,含量达到最大值;再随着浸提时间的延长,6～8 h期间虫草素含量又显著减少,后趋于平稳。分析原因可能是在一定时间范围内,随着浸提时间的延长有利于虫草素的溶出,但过长又会引起其降解,使得含量下降,因此选择浸提时间6 h。

图3　浸提时间对虫草素含量的影响Fig.3　Effect of extraction time on the content of cordycepin

2.2.2浸提温度对虫草素含量的影响结果如图4所示,在其他条件一定时,随着浸提温度的增大,虫草素含量呈现上升趋势后趋于平稳,在80℃时有一个小高峰。温度过低时,虫草素溶解不充分,而高温可使传质速度提高以此来增加虫草素的溶解度,因此选择浸提温度80℃。

图4　浸提温度对虫草素含量的影响Fig.4　Effect of extraction temperature on the content of cordycepin

2.2.3料液比对虫草素含量的影响结果如图5所示,在其他条件一定时,料液比1∶10～1∶30对虫草素含量影响很大,虫草素含量显著增加;随着料液比由1∶30增加到1∶70,虫草素含量略有增加,但变化不明显,在1∶70时达到最大值;后随着料液比的增加,又略有下降。料液比过小,容易使得虫草素的提取不完全,造成浪费,所以选择料液比1∶70。

图5　料液比对虫草素含量的影响Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on the content of cordycepin

2.3Box-Behnken实验优化虫草素提取结果

根据单因素实验结果,使用Design-Expert8.0软件,以虫草素含量为响应值,自变量包括浸提时间、浸提温度和料液比,进行3因素3水平Box-Behnken实验。对各个变量的水平进行编码,结果见表1,响应面实验设计及结果见表2。

表2　Box-Behnken实验设计及响应值

利用Design-Expert8.0软件对以上数据进行拟合回归分析,得出虫草素对编码后的自变量浸提时间、浸提温度和料液比的二次多项回归方程:

虫草素含量=6.05+0.11A-5.408×10-3B+0.093C+7.898×10-4AB-0.014AC+0.028BC-0.16A2-0.061B2-0.020C2

表3　回归模型方差分析

回归模型中各因素的系数能直观的显示各因素对虫草素得率的影响程度,其F值的大小与该因素对响应值的影响呈正相关。由表3可知,浸提时间和料液比对虫草素含量具有高度显著影响,而浸提温度对其影响不显著(p>0.05)。三个因素间两两交互作用的响应曲面和等高线图如图6所示:浸提时间与浸提温度对虫草素含量影响的交互作用相对较弱,等高线图趋于圆形;浸提时间与料液比对虫草素含量影响的交互作用相对较强,其中浸提时间变化比料液比变化对虫草素含量的影响大,其等高线更密集;浸提温度与料液比对虫草素含量影响的交互作用在三组两两交互作用中是最强的。

2.4最优提取条件验证

根据响应曲面法得出的最优提取条件为:浸提时间6.59 h、浸提温度81.9℃、料液比1∶90,在此条件下预测虫草素含量为6.1445mg/g。按照最优条件提取同一样品中的虫草素,平行测定3次,得到平均虫草素含量为6.0143mg/g,与预测值相差2.12%,证明优化的提取条件有较高的可信度。

2.5方法学考察

2.5.1精密度实验选取任一样品,在选定色谱条件下连续进样测定6次,测其峰面积计算RSD,结果见表4。

表4　精密度实验

由表4可知,连续进样6次,虫草素的RSD值为0.82%,小于2%,且色谱峰保留时间波动在0.01～0.06 min,说明该实验方法精密度良好。

2.5.2加标回收率实验选取6个样品,按样品处理方法进行处理,再加入虫草素标准品50 μg,后上机测定,计算加标回收率。

由表5可知,虫草素的加标回收率在101.96%～104.76%之间,RSD值为1.16%,说明该实验方法加标回收效果较好,可用于虫草素含量的测定。

表5　加标回收率实验

2.5.3日内稳定性实验选取任一样品分别于0、2、4、8、12、24 h时进样分析,测其峰面积计算RSD。

2.5.4日间稳定性实验选取任一样品分别于1、2、3、4、6、8 d时进样分析,测其峰面积计算RSD。

稳定性实验结果如表6和表7所示,在不同的时间进样同一样品,虫草素含量保持相对稳定,其RSD值分别为1.04%和1.79%,稳定性良好。

表6　日内稳定性实验

表7　日间稳定性实验

2.6不同光照时长对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素含量的影响

根据不同光照培养时间将蛹虫草菌丝共生体的生长过程划分为4个生长期:转色期(1～5 d)、原基形成期(5～9 d)、现蕾期(9～27 d)、子实体旺长期(35～43 d)。本实验以响应面优化后的最优提取条件为基础,对样品测得的虫草素含量见表8。

由表8可知,在实验范围内,不同光照时长之间,杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的含量差异均有统计学意义(p=0.000)。且在杂粮蛹虫草菌丝共生体生长的4个阶段,其不同阶段间的虫草素含量差异也具有统计学意义(F=88.880,p=0.000)。随着光照培养时间的延长,虫草素的含量总体上呈现先上升后下降的趋势,在19 d时含量达到最大11.9626mg/g,随后又逐渐下降并趋于稳定。实验结果表明,杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的合成和积累主要在原基形成和现蕾期,这一结果与韦会平[9]报道的现蕾期是收获虫草素的最佳时期结果相同。在现蕾期之后,杂粮蛹虫草菌丝共生体中的虫草素含量有所下降,可能是因为子实体的旺盛生长使得共生体中虫草素不断转移到子实体中。

表8　光照时长对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素含量的影响

注:方差分析方法为SNK法;不同的英文字母表示组间在p<0.05水平上差异有统计学意义。

3　结论与讨论

本研究通过测定不同光照时长条件下杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的含量,为共生体的培养条件优化和其综合利用提供了依据。首先对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的水浴提取进行了响应面优化,得到最优提取条件是:浸提时间6.59 h、浸提温度81.9℃、料液比1∶90,与李琴[10]等研究结果较为接近。在此条件下测得样品中的虫草素含量为3.8988～11.9629mg/g,并经统计学分析发现,不同光照时长对虫草素含量的影响差异显著。

本文采用的杂粮蛹虫草菌丝共生体样品为本实验室人工培养,虫草素含量的差异与环境条件和培养条件的差异有关。翁梁[11]等研究不同配方培养基中虫草素含量在蚕蛹与玉米糁质量比7∶3条件下最高,为4.75mg/g,并且得到在培养基中适量添加黄豆、玉米糁、蛋白胨更有利于虫草素、多糖、虫草酸含量提高的结论。顾冬艳[12]等优化北虫草固态发酵培养基得出大豆粉与麦麸质量比4∶1、料液比39∶30及营养液中添加葡萄糖、牛肉膏、硫酸锰,此条件下虫草素含量达到5499.12 μg/g。温鲁[13]等研究提高固体培养蛹虫草核苷类代谢物的产物,从蛹虫草菌株、培养基碳源、氮源水平、加水量、培养时间和光照等方面进行研究,在以20%豆粉为氮源、按1∶1加营养液、接种CM-2菌株、遮光培养35 d的条件下培养物的虫草素含量可达5.49mg/g,高于蛹虫草全草2.83mg/g。乐昕[14]等研究不同蛹虫草固体栽培基质(大米、小米、高粱米、玉米、小麦)对虫草素含量的影响发现,高粱米作为培养基质获得的虫草素含量较高,达到248.2 mg/100 g,而用小米培养得到的含量最低。基于以上文献比较发现可知,通过不同固体栽培基质培养蛹虫草得到子实体中的虫草素含量在5mg/g左右,而本实验所采用的杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草素的含量明显较高,特别是在合适的光照时长条件下虫草素含量能达到11.96mg/g。陆艳艳[15]等测定了人工虫草子实体、菌丝体和固体培养残基中虫草素的含量分别为1356.92、1101.04、350.96 μg/g,其中菌丝体和培养残基中的虫草素含量之和高于子实体,这也间接的说明了本实验室培养的杂粮蛹虫草菌丝共生体是很有价值的。

目前,虫草的人工栽培以收获子实体为主,而大量的培养残基被直接丢掉,造成浪费和环境污染。而本实验室以杂粮为固体培养基,接种蛹虫草后,把菌丝体和杂粮培养基作为一个整体开发利用,以期作为具有一定功效成分的膳食替代。光照时长是影响虫草生长的一个重要因素,本研究初步探讨了光照时长对虫草素含量的影响,为优化培养条件提供了一定依据。本实验室还将在本文的研究基础上,将其他功效成分纳入参考,作为下一步工艺条件优化的参考指标。

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Optimizing extraction and determination of cordycepin in multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts

CHANG Zheng-jiao,HAN Ping*,LIU Li-e,XU Yan-li,JIANG Yong-hong,WANG Wen-ning

(College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

Object:To explore the optimal extraction conditions of cordycepin in multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts,the effect of varied lighting duration on cordycepin was compared,the purpose was to provide a basis for the optimization of its technological conditions and comprehensive utilization.Methods:The conditions of waterbath extraction of cordycepin were determined by single factor experiments combined with response surface methodology,the content of cordycepin was determined by high performance liquid chromatography,SPSS 17.0 software was applied for statistical analysis.Results:The results showed that the optimal extraction conditions were:extraction time 6.59 h,extraction temperature 81.9℃,solid-liquid ratio 1∶90.The contents of cordycepin were 6.0143mg/g under this condition.The contents of cordycepin were 3.8988～11.9629mg/g in different lighting duration and were significantly different(p=0.000).Conclusions:The optimal conditions of waterbath extraction of cordycepin were determined and the contents of cordycepin were significantly different under varied lighting duration,which can provide the reference basis for further optimization of culture conditions of multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts.

multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts;cordycepin;response surface methodology(RSM);high performance liquid chromatography(HPLC);lighting duration

2015-08-07

常正姣(1988-)，女，在读硕士研究生，研究方向：营养与疾病，E-mail：bluesysbb@live.cn。

韩萍(1960-)，男，博士，教授，研究方向：营养与疾病，E-mail：hp999@zzu.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2016)07-0237-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.037