吴新涛　石晶　高乐才　孙国昌　吴文元　庞石磊



·论著·

柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的影响

吴新涛石晶高乐才孙国昌吴文元庞石磊

目的观察柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的治疗作用。方法50只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、柚皮素低、中、高剂量组，每组10只。假手术组施行假手术，其余4组均行卵巢摘除术，术后4周开始灌胃给予35、70、140 mg/kg柚皮素。12周后分别检测5组大鼠血清雌二醇(E2)、孕激素(P)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)，尿液钙(Ca)、磷(P)及脱氧吡啶啉(DPD)、骨密度(GMD)、股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷及骨小梁形态变化。结果与假手术组比较，模型组大鼠体重明显增加，子宫脏器系数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠体重较模型组明显降低，子宫脏器系数较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，并呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠血清E2、P明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清E2、P较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠血清TRACP及尿液Ca、P、DPD明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组血清TRACP及尿液Ca、P、DPD较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠血清ALP明显增加，BGP明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清ALP较模型组明显降低，BGP较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠BMD明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠BMD较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。与假手术组比较，模型组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度明显降低，骨小梁分离度明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度较模型组明显增加，骨小梁分离度较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。结论柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症具有良好的治疗作用。

柚皮素；去卵巢；骨质疏松

model group were obviously increased, however, the seum levels of BGP were significantly decreased (P<0.05).The serum levels of ALP in the three medication groups were significantly decreased,however,the serum levels of BGP were significantly increased,as compared with those in model group (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with that in sham-operation group,the BMD was significantly decreased in model group (P<0.05).The levels of BMD in the three medication groups were significantly increased, as compared with those in model group (P<0.05), with a dose-dependent manner. As compared with those in sham-operation group,the maximum bending stress and loading force of the 5th lumbar vertebra in model group were significantly decreased (P<0.05). The maximum bending stress and loading force of the 5th lumbar vertebra in low-dose,median-dose and high-dose naringenin groups were significantly increased, as compared with those in model group (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with those in sham-operation group,the percentage of bone trabecula area, bone trabecula number and thickness of bone trabecula were significantly increased in model group (P<0.05). The percentage of bone trabecula area, bone trabecula number and thickness of bone trabecula in the three medication groups were significantly increased, as compared with those in model group (P<0.05),however the resolution of bone trabecula area in the three medication groups was significantly decreased (P<0.05), with a dose-dependent manner.ConclusionNaringenin has better therapeutic effects on ovariectomy-induced osteoporosis in rats.

骨质疏松症是好发于绝经后女性、老年人和慢性疾病患者的常见病、多发病，发病原因是由于全身骨量减少、骨微细结构退化导致骨脆性及骨折风险增加。近年来，骨质疏松症发病率逐渐升高，我国60岁以上的老年人中约80%患有不同程度的骨质疏松症，其中以女性患者为主[1]。目前，临床用于预防和治疗骨质疏松症的药物主要有雌激素受体调节剂、双膦酸盐类、降钙素、氟制剂等，虽然取得了一定疗效，但长期服药不良反应大，且价格昂贵[2]。因此，寻找安全有效的防治骨质疏松症的药物已经成为当前的研究热点。中草药柚皮苷属黄酮类物质，具有抗氧化、保护神经、治疗骨质疏松症等药理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代谢产物，体外实验表明柚皮素对大鼠成骨细胞促骨形成活性要优于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素是否具有抗骨质疏松能力目前研究尚少。本研究通过建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，观察柚皮素对骨质疏松症的改善作用，旨在为柚皮素在骨质疏松症的临床应用方面提供理论依据和实验基础。

1　材料与方法

1.1动物及分组雌性SD大鼠50只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证号：SCXK-(京)2012-0001]体重180～215 g，恒温、恒湿条件下饲养，期间可自由饮食，饮水，采血前禁食12 h。50只大鼠随机分为假手术组、模型组、柚皮素低、中、高剂量组，每组10只。

1.2药品与仪器柚皮素购自南昌昌帮中药行。雌二醇(E2)、孕激素(P)放射免疫试剂盒及骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、碱性磷酸酶(ALP)、尿液脱氧吡啶啉(DPD)ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。超低温冰箱购自美国Thermo Fisher公司。双能X线骨密度测量仪购自美国GE公司。MRXⅡ型酶标仪购自美国Dynex公司。

1.3模型制备除假手术组外，其余4组大鼠均摘除双侧卵巢。操作过程：乙醚麻醉大鼠后，经背侧切口摘除双侧卵巢，送病理切片判断是否切除完整。假手术组大鼠麻醉后切除卵巢周围部分脂肪组织，保留卵巢，逐层缝合切口。大鼠术后肌内注射青霉素5万U/只，共3 d，分笼饲养。5组大鼠饮水、饮食均相同，喂养4周后灌药给药。柚皮素低、中、高剂量组分别按35、70、140 mg/kg灌胃给予柚皮素12周。假手术组灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液2 ml·kg-1·d-1。

1.4观察指标及方法

1.4.1一般状况、子宫脏器系数:每天观察并记录大鼠饮食、活动情况、皮毛色泽，治疗结束后称量一次体重，取大鼠子宫，称重，计算子宫脏器指数。子宫脏器指数=脏器质量(mg)/体重(g)。

1.4.2雌激素水平检测:采用放射免疫法检测大鼠血清E2、P水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.3生化指标检测:给药12周后采集大鼠颈动脉血10 ml，4 000 r/min离心5 min，取上清，-80℃备用。采用ELISA法检测BGP、TRACP、ALP、DPD含量，严格按照试剂盒说明书操作。采用生化分析仪检测尿Ca、P含量。

1.4.4BMD检测:5组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，四肢展开固定在双能X线骨密度检测仪上，对大鼠全身、腰椎、右侧股骨干骺端进行扫描，数据采用高分辨率的小动物软件进行分析。

1.4.5生物力学指标检测:实验结束后，处死大鼠，切开下肢皮肤，分离右下肢和L5腰椎，在不伤及骨膜情况下轻轻剥离肌肉，用浸润0.9%氯化钠溶液的纱布包裹，-20℃冰箱保存。采用微机控制电子万能试验机进行右股骨三点弯曲试验，计算最大应力和L5腰椎抗压缩载荷。

1.4.6形态指标检测:测量股骨远端干骺端生长板下1～4 mm范围内的次级松质骨，随机选取内、中、外3点处图像，采用Giemsa及VonKossa染色测定骨小梁面积、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁分离度。

2　结果

2.15组一般情况比较假手术组大鼠饮食、运动正常，皮毛颜色光泽；模型组大鼠饮食、活动次数明显减少，皮毛颜色无光泽；柚皮素低、中、高剂量组大鼠饮食、活动次数较模型组逐渐增多，皮毛颜色光亮。

2.25组体重、子宫脏器系数比较与假手术组比较，模型组大鼠体重明显增加，子宫脏器系数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠体重较模型组明显降低，子宫脏器系数较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表1。

组别体重(g)子宫(mg/g)假手术组276.32±15.510.0187±0.0013模型组340.11±19.06*0.0021±0.0006*柚皮素低剂量组328.26±18.33*#0.0042±0.0007*#柚皮素中剂量组317.63±17.22*△0.0051±0.0008*△柚皮素高剂量组306.25±14.53*▲0.0060±0.0010*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.32组性激素比较与假手术组比较，模型组大鼠血清E2、P明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；

柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清E2、P较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表2。

组别E2(ng/L)P(μg/L)假手术组26.79±3.777.02±1.23模型组6.98±0.85*3.13±0.45*柚皮素低剂量组9.46±1.21*#4.09±0.43*#柚皮素中剂量组14.68±1.90*△5.12±0.57*△柚皮素高剂量组19.23±2.32*▲6.20±0.85*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.45组骨生成指标比较与假手术组比较，模型组大鼠血清ALP明显增加，BGP明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清ALP较模型组明显降低，BGP较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表3。

组别ALP(U/L)BGP(μg/L)假手术组71.34±6.5629.04±4.35模型组170.13±10.53*9.67±1.12*柚皮素低剂量组156.32±9.56*#13.28±1.65*#柚皮素中剂量组117.64±8.58*△17.44±2.67*△柚皮素高剂量组87.54±6.50*▲22.69±3.25*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.55组骨吸收指标比较与假手术组比较，模型组大鼠血清TRACP及尿液Ca、P、DPD明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组血清TRACP及尿液Ca、P、DPD较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表4。

组别TRACP(U/L)Ca(mmol/L)P(mmol/L)DPD(nmol/L)假手术组18.57±2.410.38±0.0528.45±4.3740.42±6.29模型组49.33±7.24*1.35±0.18*54.20±6.51*89.55±9.12柚皮素低剂量组40.51±6.37*#1.08±0.14*#47.97±6.18*#75.18±8.36柚皮素中剂量组32.44±5.12*△0.83±0.16*△40.12±5.43*△63.44±7.09*△柚皮素高剂量组27.77±4.20*▲0.60±0.09*▲34.65±4.35*▲52.14±7.24*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.65组BMD比较与假手术组比较，模型组大鼠BMD明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠BMD较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表5。

组别全身腰椎右股骨假手术组0.158±0.0020.239±0.0040.185±0.003模型组0.110±0.001*0.156±0.002*0.148±0.002*柚皮素低剂量组0.125±0.001*#0.169±0.002*#0.158±0.001*#柚皮素中剂量组0.137±0.002*△0.182±0.003*△0.169±0.002*△柚皮素高剂量组0.149±0.003*▲0.201±0.004*▲0.178±0.003*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.75组病理指标比较与假手术组比较，模型组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度明显降低，骨小梁分离度明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度较模型组明显增加，骨小梁分离度较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表6。

组别骨小梁面积百分数(%)骨小梁数(mm-1)骨小梁厚度(μm)骨小梁分离度(μm)假手术组57.22±7.358.87±0.12147.78±18.65155.02±19.45模型组34.16±4.45*4.13±0.56*89.56±10.43*277.12±23.45柚皮素低剂量组39.32±5.17*#4.99±0.62*#99.58±11.56*#230.67±20.23柚皮素中剂量组45.56±5.82*△6.14±0.78*△111.44±13.09*△216.68±18.87*△柚皮素高剂量组51.63±6.34*▲7.65±1.12*▲125.65±16.05*▲190.77±17.98*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

2.85组生物力学指标比较与假手术组比较，模型组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素低、中、高剂量组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表7。

组别股骨三点弯曲应力(MPa)L5腰椎抗压缩载荷(N)假手术组21.78±3.23249.21±18.65模型组13.07±2.15*160.22±12.24*柚皮素低剂量组15.33±2.26*#189.43±10.68*#柚皮素中剂量组17.24±2.47*△210.35±12.46*△柚皮素高剂量组19.57±3.03*▲229.62±15.38*▲

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与柚皮素低剂量组比较,△P<0.05;与柚皮素中剂量组比较,▲P<0.05

3　讨论

骨质疏松症的主要病理过程是由于骨代谢过程中骨形成相对减弱或骨吸收相对增强，造成机体钙磷代谢失衡、骨质丢失和骨微结构紊乱，最终导致骨质疏松症发生[5]。Ca、P、DPD是反应骨吸收过程的重要指标。Ca、P具有促进骨基质合成和骨矿沉积的作用，在骨质丢失状况下尿液Ca、P含量增加。DPD是骨吸收过程中Ⅰ型胶原的分解产物，以原型经肾脏排出[6]。TRACP是由破骨细胞合成的反映破骨细胞活性和骨吸收状况的敏感指标[7]。ALP是广泛分布于各组织中参与骨矿化和骨形成的酶，当骨矿沉积不足时，成骨细胞分泌ALP增多，是反应成骨细胞活性和骨矿化障碍的最佳指标[8]。BMD、骨生物力学改变直接反映骨矿含量和骨质状态，BMD降低提示骨矿含量减少，骨弯曲应力和抗压载荷下降提示骨质脆弱。本研究采用切除双侧卵巢模拟骨质疏松症的经典方法，结果显示，与假手术组比较，大鼠去除卵巢后体质量、血清TRACP、ALP、BGP及尿液Ca、P、DPD含量明显增加，子宫脏器系数、血清E2、P含量及BMD、股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷明显降低，股骨骨小梁微体系紊乱，说明大鼠去除卵巢后，体内性激素水平及子宫发育质量降低，骨代谢处于高转换状态，因此本研究大鼠骨质疏松症模型建立成功[9]。

研究发现，中草药柚皮苷能够对骨质疏松小鼠模型发挥一定程度保护作用，而柚皮苷经口服途径进入体内后的主要代谢物为柚皮素。体外实验表明柚皮素对大鼠成骨细胞也具有促骨形成活性，且较柚皮苷有所增加[3,4]。本研究通过分析柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松的影响，结果显示，治疗12周后柚皮素能够明显降低去卵巢所致大鼠体重增加、血清TRACP、ALP、BGP及尿液Ca、P、DPD含量，增加血清E2、P含量及BMD、股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷，改善子宫脏器系数、股骨骨小梁微体系结构，说明柚皮素通过促进骨形成、抑制骨吸收维持骨量平衡，从而治疗骨质疏松症。

综上所述，柚皮素能够明显调节骨质疏松症大鼠骨代谢，抑制高骨转换速率，改善骨质疏松症的病理学改变。本研究表明柚皮素在骨质疏松症治疗中具有广阔的应用前景。

1Kaku M, Rocabado JMR, Kitami M, et al. Royal jelly affects collagen crosslinking in bone of ovariectomized rats. Journal of Functional Foods,2014,13:398-406.

2史传道，樊晓晨，邓海东. 抗疏健骨颗粒对骨质疏松模型大鼠骨密度和骨生物力学的影响. 河南中医，2012，32：831-833.

3Pang WY, Wang XL, Mok SK, et al. Naringin improves bone properties in ovariectomized mice and exerts oestrogen-like activities in rat osteoblast-like (UMR-106) cells. Br J Pharmacol,2010,159: 1693-1703.

4Ang ES, Yang X, Chen H, et al. Naringin abrogates osteoclastogenesis and bone resorption via the inhibition of RANKL-induced NF-kappaB and ERK activation. FEBS Lett,2011,585: 2755-2762.

5刘明，潘薇，陈德才. 甲状旁腺激素治疗骨质疏松的研究进展.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2012，5：151-156.

6程敏，王庆伟，刘雪英，等. 女贞子治疗去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究.中国药理学通报，2013，29：229-233.

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8肖恩. 骨质疏松骨代谢生化指标的研究进展.中国骨质疏松杂志，2008，14：212-216.

9Zhang YY,Zhang RH，Xue Y，et al. The relationship of obesity and estrogen and their impact on uterus.Acta Univ Med Nanjing,2013: 060-1065.

Effects of naringenin on osteoporosis in ovariectomized rats

WUXintao,SHIJing,GAOLecai,etal.

DepartmentofOsteology,CangzhouHospitalofIntegratedTCMwithWesternMedicine,Hebei,Cangzhou061001,China

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effects of naringenin on osteoporosis in ovariectomized rats.MethodsFifty female SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group, low-dose naringenin group,median-dose naringenin group and high-dose naringenin group,with 10 rats in each group. Except for the rats in sham-operation group,the rats in the other 4 groups underwent ovariectomy. On 4 weeks after operation, the rats in low-dose naringenin group,median-dose naringenin group and high-dose naringenin group were given naringenin by gavage, with the dosage of 35mg/kg, 70mg/kg, 140mg/kg, respectively for 12 weeks. Then the serum levels of estradiol (E2), progesterone (P), tartrate resistant acid phosphatase (TRACP), bone alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (BGP), urine calcium (Ca), phosphorus (P) and deoxypyridinoline (DPD), bone mineral density (BMD), the maximum bending stress,loading force of the 5th lumbar vertebra and morphologic changes of bone trabecula were detected and compared among the 5 groups. ResultsAs compared with that in sham-operation group,the body weight in model group was obviously increased, however, uterus organ coefficient was significantly decreased (P<0.05). The body weight in the three medication groups was obviously decreased, however, uterus organ coefficient was significantly increased,as compared with that in model group (P<0.05),with a dose-dependent manner.As compared with those in sham-operation group,the serum levels of E2 and P in model group were significantly decreased (P<0.05). However the serum levels of E2 and P in the three medication groups were significantly increased, as compared with those in model group (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with those in sham-operation group,the serum levels of TRACP,Ca,P,DPD in model group were significantly increased (P<0.05),however, which in the three medication groups were significantly decreased,as compared with that in model group (P<0.05), with a dose-dependent manner. As compared with those in sham-operation group,the serum levels of ALP in

naringenin;ovariectomized;osteoporosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.17.004

061001河北省沧州中西医结合医院骨科(吴新涛、石晶、高乐才、吴文元、庞石磊)；河北省沧州市南大港医院骨科(孙国昌)

R 681.4

A

1002-7386(2016)17-2575-04

2016-03-18)

项目来源：河北省中医药管理局科研计划项目(编号:2016267)