彭　聪，彭南秀，段晓冬，沈　丹，杨穗娟，陈耀棠，谭　海，薛　红，张　桢，肖　杰，张海冰，郑丽兰，钟锦辉，黄　森，朱家辉，林　鸿，胡永辉，殷　实，邓小敏，曾佳臻，邝惠仪，杨秋菲，陈　裕，朱建翠，蓝国文，张海明（.广州市动物卫生监督所，广东广州　50440；.番禺区动物防疫监督所，广东广州　5400）

广州市活禽交易市场休市效果评估队列研究

彭聪1，彭南秀1，段晓冬1，沈丹1，杨穗娟1，陈耀棠2，谭海1，薛红1，张桢1，肖杰1，张海冰1，郑丽兰1，钟锦辉1，黄森1，朱家辉1，林鸿1，胡永辉1，殷实1，邓小敏1，曾佳臻1，邝惠仪1，杨秋菲1，陈裕1，朱建翠1，蓝国文2，张海明1
（1.广州市动物卫生监督所，广东广州510440；2.番禺区动物防疫监督所，广东广州511400）

［目的］了解目前广州市活禽交易市场每月休市一次（天）的实施效果，给人感染H7N9等流感病毒的科学防控提供技术依据。［方法］2015年3月，选择广州市某区1个活禽批发市场和2个活禽零售市场，分别于休市前、休市中，以及休市后的1、2、3、4、5、7、14、21和28天，采集市场内环境棉拭子和活禽口咽/泄殖腔棉拭子，共2 470份，进行通用型禽流感病毒荧光RT-PCR检测。［结果］研究发现，休市前、中、后各检测时点，环境样品中禽流感病毒阳性率分别为17.78%、10.00%、5.19%、29.63%、21.48%、22.96%、22.22%、45.93%、40.74%、47.41%和25.19%。虽然活禽交易市场在休市后禽流感病毒有非常明显的减少，但是阳性率在休市后第二天就开始显著升高，而且环境样品中病毒阳性率与活禽样品中病毒阳性率呈明显的统计学相关性（Pearson相关系数为0.82）。［结论］本研究是国内首次活禽交易市场（包括活禽批发市场和活禽零售市场）每月一次（天）休市效果的队列研究。研究显示，每月一次（天）的休市能迅速减少活禽交易市场内禽流感病毒的污染，但是随着市场的重新开放，感染禽流感病毒活禽的重新进入，市场内禽流感病毒阳性率再次迅速升高。推测仅仅依靠每月一次（天）的休市措施，无法从根本上降低本地区活禽交易市场内禽流感病毒的污染程度以及人感染禽流感的风险，需进一步调整防控策略，采取综合的防控措施。

每月一次休市；活禽交易市场；阳性率；禽流感病毒

全球首例人H7N9流感病例于2013年3月发现于我国东部地区［1］，此后导致多人死亡。该事件不仅造成了极大的恐慌，也给整个家禽产业带来了巨大的损失，并引发又一次流感大流行的争论和关注［2-4］。以往的研究［5-6］显示，活禽交易市场是人感染H7N9等亚型流感病毒的来源地。因此很多地方采取了包括关闭活禽交易市场在内的控制措施。并且一些研究［7］也证明了关闭活禽市场对于控制H7N9流感人间疫情是有效的。然而，活禽市场关闭措施的实施使得家禽养殖场、散养户以及其它家禽相关产业损失巨大，不仅给我国的养殖、交易、销售等整个家禽产业带来了非常大的负面影响，也在一定程度上影响了社会和谐与稳定［8-9］。而且，在传统消费习惯和饮食文化影响下，购买现宰活禽的生活习惯很难在短时间内发生彻底的改变，特别是在我国南方地区。政府强制关闭活禽交易市场，还导致很多地方出现了大量街头流动式、作坊式的活禽售卖和宰杀点，使得风险源增多且更为分散，反而增加了人感染H7N9 等亚型流感病毒的风险，更不利于政府发挥监管职能［10］。因此，作为我国第二波和第三波H7N9流感人间疫情暴发中心之一的广东省［11-12］，从2015年3月开始，在全省所有活禽交易市场，实施每月一次（天）的休市制度。该制度要求，所有进行活禽售卖的批发市场和零售市场，在休市前一天必须将所有活禽售完或宰杀，市场内所有档口必须彻底清洗和消毒，并且空栏一天。但到目前为止，这种制度的实施效果尚不是十分清楚。基于此，挑选了广州市的1个活禽批发市场和2个活禽零售市场，进行了如下休市效果评估研究。

1　材料和方法

1.1 主要试剂

5×MagMAXTM 96 RNA 提取试剂盒和A型动物流感荧光RT-PCR检测试剂盒，购自Ambion 公司。

1.2 研究对象和采样时间

2015年3—4月，挑选较有代表性的广州市某区1个活禽批发市场和2个活禽零售市场进行休市效果研究。在目前开展的清洗消毒休市的情况下，于休市前1天、休市中，以及休市后1、2、3、4、5、7、14、21、28天（共11个时间点）进行采样。

1.3 抽样策略及抽样方式

对活禽批发市场，采取两阶段分层随机抽样：第一阶段的抽样对象是市场内的档口，每次对档口以简单随机抽样方式抽取（即每次抽取的档口都不一定相同）；第二阶段的抽样对象是档口内的环境样品和活禽样品，以简单随机抽样方式抽取。对活禽零售市场，采集市场内各档口的内、外环境样品，以及活禽样品，尽量兼顾每个档口。

1.4 样本量计算及样品采集

对活禽批发市场：第一阶段（市场内的档口），按照该活禽批发市场内不同家禽种类的档口数量，以估计流行率方式，计算样本量。按照50%的档口预期流行率、30%的可接受绝对误差和95%的置信水平，每次随机抽取8个鸡档、5个水禽档和2个鸽档。第二阶段（档口内的活禽），根据每个档口内活禽的存栏量，以发现疫病方式计算样本量。按照每个档口50%的个体预期流行率、90%的试验敏感性、95%的置信水平，在每个抽取档口，各抽取5份活禽棉拭子和5份环境拭子。同时，在每个市场，每次采集10份档口外环境棉拭子。

对活禽零售市场：每个档口采集5份环境棉拭子，同时在每个市场采集5份档口外环境棉拭子；对每个市场的鸡、水禽和其它家禽，各采集5份棉拭子。

对环境样品（饮水、粪便、污水、垃圾桶、砧板等）：需采集潮湿和脏环境中的样品，并且需1 份/管，在管上标明样品种类（如饮水）并进行唯一性编号。对采集的家禽口咽/泄殖腔棉拭子，每5份合1份，并进行唯一性编号。将所有棉拭子放入装有灭菌PBS 的2 mL EP 管中，-20 ℃冻存备用。

1.5 实验室检测

对通用型禽流感病毒检测，采用A 型动物流感荧光RT-PCR 检测试剂盒，操作及结果判定按照试剂盒说明书进行。

1.6 数据分析和统计

以Excel、SPSS 20 和Epi Info 6.0进行数据分析和统计。用Ausvet pooled prevalence calculator进行活禽棉拭子的禽流感病毒阳性率估算［13］。

2　结果

2.1 总体情况

被调查的1个活禽批发市场共有37个活禽经营档口，其中经营鸡、水禽和鸽子的档口数分别为28个、7个和2个。在本次研究中，每次分别采集8个鸡档、5个水禽档和2个鸽档样品。2个活禽零售市场分别有7个和5个活禽经营档口。本次调查总共采集2 470份样品，其中包括1 050份活禽口咽/泄殖腔棉拭子和1 420份环境棉拭子。这2种样品总的通用型禽流感病毒阳性率分别为12.60%和 26.90%。

2.2 活禽交易市场休市前、中、后不同时间点的阳性率变化

休市前、休市中，以及休市后的1、2、3、4、5、7、14、21和28天，环境样品中禽流感病毒阳性率分别为17.78%、10.00%、5.19%、29.63%、21.48%、22.96%、22.22%、45.93%、40.74%、47.41% 和25.19%；活禽样品中估算的禽流感病毒阳性率分别为11.12%、0、3.55%、7.79%、11.12%、7.79%、17.31%、22.78%、15.04%、22.78%和15.04%。休市时，由于市场内没有活禽，无法进行采样和检测。具体结果见图1。

图1　休市前、中、后不同时间活禽交易市场AIV阳性率变化

从以上结果可知，活禽交易市场在实施每月一次（天）的休市后，市场内的禽流感病毒阳性率（以环境样品禽流感病毒阳性率为指标）明显下降，一直持续到休市后第1天，但休市后第2天又显著上升，而且总体呈上升趋势。同时，休市前、中、后不同时间点的环境样品禽流感病毒阳性率变化趋势与活禽样品基本一致（图1），呈明显的统计学相关性，Pearson相关系数达到0.82。

2.3 活禽批发市场休市前、中、后不同时间点的阳性率变化

休市前、休市中和休市后第1、2、3、4、5、7、14、21和28天，批发市场内环境样品的禽流感病毒阳性率分别为14.12%、16.67%、5.88%、30.59%、12.94%、12.94%、9.41%、38.82%、37.65%、55.29%和16.47%。从结果可知，在活禽批发市场实施休市措施后，市场内禽流感病毒阳性率呈略微上升趋势，差异不显著（p＞0.05），在休市后第1天阳性率最低，但在休市后第2天突然升高，随后呈不规则的变化趋势，具体见图2。

2.4 活禽零售市场休市前、中、后不同时间点的阳性率变化

休市前、休市中和休市后第1、2、3、4、5、7、14、21和28天，零售市场内环境样品的禽流感病毒阳性率分别为24.00%、2.50%、4.00%、28.00%、36.00%、40.00%、44.00%、58.00%、46.00%、34.00%和40.00%。从结果可知，活禽零售市场在实施休市措施后，市场内禽流感病毒阳性率显著下降，随后从休市后第2天开始逐渐上升，虽然在休市后第14天和21天有下降，但总体呈上升趋势。

图2　休市前、中、后不同时间活禽批发和零售市场环境样品中AIV阳性率变化

2.5 基于环境样品中禽流感病毒阳性率的休市效果评估

如表1所示，以休市中市场内环境样品的禽流感病毒阳性率作为参照，对休市前和休市后不同时间点计算OR值，并进行统计学分析，发现仅休市后第1天的OR值小于1，且差异不显著（p＞0.05），其余时间点的OR值均大于1。分别对活禽批发市场和零售市场进行休市效果评估，与总体结果基本相同，具体见表2和表3。

表1　基于环境样品中的禽流感病毒阳性率的休市效果评估

3　讨论

活禽交易市场是不同来源、不同批次、不同种类活禽的聚集地，加上市场（特别是活禽零售市场）内卫生条件较差、场地狭小，以及活禽交易频繁、运输车辆与人员流动频繁等，一旦引入感染禽流感病毒的活禽，病毒会在场内复制和扩散，甚至进一步重组演化。特别是，如果家禽进入市场后不能及时售出，随着停留时间的延长（超过24小时），禽流感病毒核酸检测阳性率就会明显提高［14］。我国南方地区，尤其是广东省，居民喜欢到活禽零售市场购买现宰活禽，这种行为更增加了人通过活禽零售市场感染禽流感的风险［15］。目前的研究也认为，活禽市场是人感染H5N1、H7N9 等亚型流感病毒的高风险区域［16-17］。因此，为降低人感染H7N9流感病毒的风险，上海、杭州等地采取了较长时间关闭活禽交易市场等措施。但是目前广东省采取的每月一次（天）的活禽交易市场休市措施的效果还不十分清楚。

表2　基于环境样品中禽流感病毒阳性率的批发市场休市效果评估

表3　基于环境样品中禽流感病毒阳性率的零售市场休市效果评估

本研究是国内首次系统的活禽交易市场（包括活禽批发市场和活禽零售市场）每月一次（天）休市效果队列研究。研究发现，虽然在活禽交易市场实施的每月一次（天）休市措施能迅速降低禽流感病毒的检出阳性率，但干预效果持续时间较短。病毒检出阳性率在休市后第2天即开始升高，随后总体上呈上升趋势。本研究结论与Trock等［18］的结果基本一致，认为虽然清洗/消毒措施能迅速降低活禽市场内的禽流感病毒检出阳性率，但会迅速反弹。本研究结论与香港学者Kuang等［19］的研究结论不同的是，他们研究发现活禽零售市场每月一次的休市措施能显著降低市场内禽流感病毒分离率。造成该差异的主要是因为Kuang等仅仅分析了休市前、休市后2个时间点，而本研究系统地分析了休市前、休市中、休市后整个休市周期（即一个月）内的禽流感病毒检出阳性率的动态变化。如果仅仅按照休市前和休市后2个时间点进行比较，则本研究结果与该学者的研究结果基本一致。另外一个可能的原因是，香港地区与广州市活禽交易市场中的活禽来源不同，广州市活禽交易市场的活禽来源更为复杂。

对于活禽批发市场，由于每次抽取的档口不同，而不同档口的家禽来源差异较大，导致了活禽和环境样品的禽流感病毒阳性率的变化。同时，本研究发现，活禽交易市场内环境样品的禽流感病毒阳性率与活禽样品的病毒阳性率呈明显的相关性，这也进一步证明了在市场重新开放后，由于引入感染禽流感病毒的活禽而重新发生了污染，而且也在一定程度上解释了活禽批发市场内环境样品禽流感阳性率的不规则变化。

基于以上分析，本研究认为仅仅通过在活禽交易市场实施每月一次（天）的休市措施，无法从根本上降低本地区禽流感的发生风险，以及人通过活禽交易市场感染禽流感的风险。基于此，研究认为需考虑采取其它一些防控措施，如适当延长休市时间、增加休市频次、禁止活禽过夜等，并且要从源头上控制养禽场的感染，从过程中减少流通环节和周期，从销售形式方面逐步推行家禽屠宰上市。

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（责任编辑：朱迪国）

The Cohort Study on Effect of Monthly Closing Day in Live Poultry Markets in Guangzhou City

Peng Cong1，Peng Nanxiu1，Duan Xiaodong1，Shen Dan1，Yang Suijuan1，Chen Yaotang2，Tan Hai1，Xue Hong1，Zhang Zhen1，Xiao Jie1，Zhang Haibing1，Zheng Lilan1，Zhong Jinhui1，Huang Sen1，Zhu Jiahui1，Lin Hong1，Hu Yonghui1，Yin Shi1，Deng Xiaomin1，Zeng Jiazhen1，Kuang Huiyi1，Yang Qiufei1，Chen Yu1，Zhu Jiancui1，Lan Guowen2，ZhangHaiming1
（1.Guangzhou Animal Health Inspection Institution，Guangzhou，Guangdong 510440；2.Panyu Animal Disease Prevention and Control Center，Guangzhou，Guangdong 511400）

［Objective］For the purpose of providing technical evidence for scientific control of human H7N9 infection，evaluating the effectiveness of monthly market closing measure. ［Methods］ One wholesale live poultry market and two retail live poultry markets in Guangzhou city were selected in March 2015. The environmental swabs and live poultry oral/cloacal swabs were sampled before，during and after the market closing day，and 2 470 samples were collected in total and then tested for type A avian influenza virus（AIV）by fluorescence RT-PCR. ［Results］ The positive rates of virus in environmental samples in 11 rounds samplings were 17.78%，10.00%，5.19%，29.63%，21.48%，22.96%，22.22%，45.93%，40.74%，47.41% and 25.19%，respectively. The results showed that although the positive rate of AIV declined dramatically on the day just after the market closing，the rates increased significantly from the second day afterwards. Besides，the positive rate of virus in the environmental samples increased with a similar trend to that of the poultry samples（Pearson correlation coefficient was 0.82）.［Conclusions］ This study is the first reported cohort study on the effect of monthly closing day in live poultry markets of China. The results indicate that although the monthly market closing practiceappearsto reduce AIV loads in LPMs，the effect is temporary.And it is indicated that AIV positive rate rose sharply again with the opening of the market and re-introduction of AIV infected live poultry. This suggests that the monthly market closing measure alone maynot be sufficient to control and eradicate AIV in this area.

monthly closing-day；live poultry market；positive rate；avian influenza virus

S851.38

B

1005-944X（2016）08-0003-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.002

广东省农业厅H7N9流感联合攻关项目（粤农函〔2014〕1046号）；广东省省级科技计划项目“H7N9亚型禽流感诊断方法和综合防控技术研究”（2013B020224004）

张海明

注：彭 聪，彭南秀，段晓冬，沈 丹同为第一作者