安徽 吴志强

微生物实验室培养的知识要点解读

安徽 吴志强

根据近年高考全国卷命题特点和规律，微生物的实验室培养有关知识的考查更加注重与之相关的基础知识，并突出重点，主要涉及培养基、无菌技术、微生物的纯化培养以及实验注意事项等方面。因此在复习中，要将这几点的基础知识梳理清晰，不需要对知识点挖掘得很深，但需要适当拓展视野。同时侧重于实验的回顾与温习，特别注意各个实验的设计流程、操作要领、结果分析和方法改进等方面的内容。

一、微生物培养的培养基

微生物培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。值得提出的是，在固体培养基上，微生物可以形成肉眼可见的菌落。比如肺炎双球菌中的S型菌和R型菌。无论是哪种类型的培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。为微生物的代谢提供碳元素的物质就是碳源，可以是无机碳源，如CO2、NaHCO3等，也可以是有机碳源，如糖类、蛋白质或脂肪等。具体碳源的选择是需要根据培养的微生物来决定的，如异养微生物只能利用有机碳源。为微生物的代谢提供氮元素的物质就是氮源，如N2（固氮微生物）、氨基酸、蛋白质和各种含氮的无机盐等。除了这四种营养物质外，培养基还需要考虑酸碱度、气体的含量以及特殊营养物质等。

【例1】甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）

粉状硫__ _10 g __ CaCl20.5 gⅠ+ + + + - + + +Ⅱ+ + + - + + + +Ⅲ__+ ___+ __+ + ____+ __+ __+ __+ K2HPO44 g__ _ FeSO40.5 g_蔗糖10 g ___（NH4）2SO40.4 g___ H2O 100 mL MgSO49.25 g

A. 甲、乙、丙都是异养微生物

B. 甲、乙都是自养微生物、丙是异养微生物

C. 甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物

D. 甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物

【解析】本题考查微生物的营养，属于对识记层次的考查。甲能在Ⅰ和Ⅲ培养基中生长繁殖，不能在Ⅱ培养基中生长繁殖，说明甲是固氮微生物；乙能在Ⅱ和Ⅲ培养基中生长繁殖，不能在Ⅰ培养基中生长繁殖，说明乙是自养微生物；丙能在Ⅲ培养基中生长繁殖，而不能在Ⅰ和Ⅱ培养基中生长繁殖，说明丙是异养微生物。

【答案】C

二、微生物培养的无菌技术

在微生物培养过程中，最为关键的就是防止外来杂菌的入侵，最常用的方法就是消毒与灭菌。消毒是一种较为温和的方法，一般采用物理或化学方法，如煮沸消毒法、红外线消毒、化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒，这种方法仅仅杀死物体表面或内部一部分杂菌微生物，但是杂菌微生物的芽孢和孢子不能被杀死。灭菌的效果要强烈得多，一般使用强烈的理化方法，如灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等方法，杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

【例2】在对微生物接种时，若不进行严格无菌操作，对实验结果影响最大的一项是 （ ）

A. 将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B. 将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C. 将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D. 将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

【解析】本题考查无菌操作的相关知识，属于对识记、理解层次的考查。作为植物组织培养，要求非常严格的无菌环境，如果灭菌不彻底，培养过程中存在污染，会造成培养的幼苗生长缓慢甚至培育失败。首先，污染的杂菌与幼苗竞争培养基中的营养，同时细菌和真菌生殖比植物快得多，这会导致幼苗死亡。其次，杂菌可能寄生于植物体内，利用植物细胞的营养合成杂菌自身物质，导致幼苗死亡。此外，污染菌的基因可通过某种暂时未知细节的机制装入植物细胞内并表达，从而导致培养失败。不进行严格灭菌对葡萄酒的制作和臭豆腐的制作影响都不是很大，因为一般的杂菌在这些环境中很难生存。

【答案】C

三、微生物培养的纯化

在实际生产过程中，很多时候都是需要对微生物进行纯化。微生物在纯化时，常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。这两种方法都使聚集在一起的多种微生物分散成单个个体，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。平板划线法是用接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

【例3】要想检测并纯化土壤中细菌，下列实验操作的叙述错误的是 （ ）

A. 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B. 取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C. 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时

D. 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验

组平板进行计数

【解析】检测并纯化土壤中的细菌，首先用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数。所以D的表述错误。

【答案】D

四、微生物培养实验的注意事项

微生物培养实验中，有很多事项需要注意。比如菌种的临时保存方法，将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在适宜的温度下培养成菌落后，再将菌种放入低温（4℃）中保存。这种方法的缺点是保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。一般在低温保存半年后，需要将菌种重新接种保存。因此，对需要长期保存的菌种，最好采用甘油管藏的方法（菌液转移到甘油瓶，－20℃的冷冻箱中保存）。再比如，灭菌后培养基冷却到55℃后应及时进行倒平板操作。如果不能及时操作，需要将培养基放到55℃左右的电热箱中保温，以防止琼脂凝固。还有实验结束后，所有用过的培养基、培养液等需要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，以免造成环境污染等。

【例4】利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现在野生菌株对淀粉的转化效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株，其设计实验步骤如下。

（1）配置________（填“固体”“半固体”或“液体”）培养基，该培养基的碳源应为_______。

（2）将________接入已灭菌的培养基平板上。如果在实验中需要检测培养基是否被污染，对固体培养基应采用的检测方法是________。

（3）立即用适当剂量的紫外线照射，其目的是_______ _______________。

（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________。

（5）菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现_______现象的菌落即为初选菌落。经分离、纯化后即可达到实验目的。

（6）实验最后，使用过的培养基及其培养物必须经过_______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

【解析】利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，第一步应是配制固体培养基，其碳源是玉米淀粉；其次要将野生菌株接种到培养基上；用紫外线照射的目的是对野生菌株进行诱变处理；加碘液是为了检验淀粉有没有被分解，如果颜色变浅，说明淀粉被分解了，这种菌落即为初选菌落。对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。因为有的微生物会释放一种强烈的毒素或者对环境造成影响，因此，使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

【答案】（1）固体 玉米淀粉 （2）野生菌株 将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 （3）对野生菌株进行诱变 （4）鉴定（或分类） （5）浅色范围大 （6）灭菌

对微生物的培养的相关知识，除了上述几点外，有时也会以果酒、果醋或腐乳的制作作为试题考查背景材料，结合微生物的培养应用进行综合考查。这就需要广大师生，在平时的复习中，要特别留意相关知识间的联系，如，微生物的营养与代谢联系、微生物发酵条件的控制等。

（作者单位：安徽省芜湖市第十二中学）