李笑笑， 张文斌， 杨瑞金

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)



超声处理核桃仁及其提取物的抗氧化性分析

李笑笑， 张文斌*， 杨瑞金

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

[目的]提取活性较高的核桃多酚，提高核桃的利用价值。[方法]采用添加0.05 mol/L盐酸的70%乙醇溶液超声辅助的方法处理核桃仁，Folin-Ciocalteau法测定总酚含量，并测定其清除自由基能力及铁离子还原能力表征抗氧化活性。[结果]4次超声提取(65 ℃, 10 min)的核桃多酚提取液多酚含量为(12.03±0.16) mg/g，核桃仁中的多酚残留量为0.38 mg/g，低于碱处理后的核桃仁多酚残留量。此外，核桃多酚提取物在清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基能力及铁离子还原能力均高于叔丁基对苯二酚(TBHQ)、VC和VE。[结论]酸化乙醇超声处理核桃仁不仅可以有效去除核桃多酚，还为食品工业提供了高活性的天然抗氧化剂。

核桃仁；多酚；抗氧化活性；超声提取

1材料与方法

1.1材料与试剂核桃仁，乌鲁木齐亚心红商贸有限公司； 95%乙醇、盐酸、丙酮、无水碳酸钠、吐温-80、氯仿、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、过硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠等，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Folin-Ciocalteau试剂、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、胡萝卜素、VE，Sigma公司。

1.2仪器设备 RV10型旋转蒸发仪，广州仪科实验技术有限公司；101-1-B型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；KQ5200DE型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；SZC-101型脂肪测定仪，上海纤检仪器有限公司；TGL-16M型冷冻离心机，上海卢液离心机仪器有限公司；A11型研磨机，德国IKA公司；UV-1100紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DELTA320型pH计，上海梅特勒公司；M5型酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.3方法

1.3.1核桃种皮多酚的超声提取。挑选大小均一、颗粒饱满的核桃仁，按照1∶5的料液比，将核桃仁放入用0.05 mol/L盐酸酸化的70%乙醇溶液中，65 ℃条件下，超声提取10 min，将提取液取出后迅速冷却，再重复提取3次，将4次的提取液合并，过滤2次后保存于-80 ℃备用。

1.3.2碱脱皮方法。根据刘淼的方法[10]略作修改，按照1∶5的料液比将干净的核桃仁加入到浓度0.9%的氢氧化钠溶液中，浸泡温度78 ℃，期间不断搅拌，浸泡5 min后取出并迅速用流水冲洗干净。

1.3.3核桃仁残留多酚的提取。准确称取2 g分别经上述2种方法处理的核桃脱脂样品于离心管中，加入20 mL的80%丙酮，将管盖拧紧并混匀，然后超声30 min，超声期间加入冰块保持低温，每隔2 min取出涡旋混匀，超声之后6 000 r/min离心10 min，收集上清液，所有提取过程再重复2次，合并3次的提取液，45 ℃旋蒸后冷冻干燥，粉末用70%甲醇定容至2 mL，保存于-80 ℃待用。每个样品共提取3份[11]。

1.3.4核桃多酚含量的测定[12]。采用Folin-Ciocalteu法进行测定，移取 100 μL核桃多酚提取液于 10 mL 比色管中，加入 500 μL Folin-Ciocalteu试剂及 2.5 mL Na2CO3溶液(20%，W/V)，蒸馏水定容。室温避光静置 1 h 后测定反应液在波长725 nm 处的吸光值。以同体积的标准溶液代替样品溶液进行测定，制作标准曲线，最终结果表示为 1 g 核桃仁相当于没食子酸的毫克数[(mg(没食子酸)/g(核桃仁)]。

1.3.5DPPH自由基清除能力的测定[13-14]。将处理过的核桃多酚提取液样品，以TBHQ、VC、VE为对照，用95%乙醇配制成质量浓度分别为20、40、60、80、100 μg/ mL的溶液。取上述各溶液0.1 mL，加入3.9 mL 60 μmol/L DPPH(乙醇配制)，充分混匀，37 ℃保温60 min。以95%乙醇为空白对照，在波长517 nm处测定其吸光值，样品吸光值记做AC，空白对照记做Ai，求清除率(RSADPPH)。

1.3.6ABTS自由基清除能力的测定[15]。取7 mmol/L ABTS乙醇溶液50 mL和5 mmol/L过硫酸钾乙醇溶液50 mL，混合，室温避光静置12 h，作为反应贮备液，然后用70%乙醇稀释，使其吸光值在波长734 nm处为0.70±0.02；将处理过的核桃多酚提取液样品，以TBHQ、VC、VE为对照，用70%乙醇配成浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL的溶液。取各样品溶液0.1 mL，加入3.9 mL反应贮备，混合，室温避光6 min，在734 nm波长处测其吸光值(As)，以70%乙醇溶液作为对照(AC)，则其ABTS的清除率(RSAABTS)。

1.3.7铁离子还原能力的测定[16]。将处理过的核桃多酚提取液样品，用蒸馏水配成浓度分别为20、40、60、80、100 μg/ mL 的溶液。各取2 mL，加入2 mL 0.2 mol/mL pH 6.6磷酸盐缓冲溶液和2 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混匀，50 ℃水浴20 min；取出待测样，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液；得到的反应混合液，于3 000 r/min离心10 min，取上清液4 mL，加入4 mL蒸馏水和0.8 mL 0.1%三氯化铁溶液，振荡混合均匀，在700 nm波长处测定其吸光值。

1.3.8抗脂质过氧化能力的测定。取0.2%β-胡萝卜素氯仿溶液0.5 mL、10%亚油酸氯仿溶液0.2 mL、20%吐温-80氯仿溶液10 mL，混合均匀，40 ℃旋干后，加入100 mL去离子水，剧烈振荡5 min，形成乳状液；取45 mL上述乳状液和4 mL 0.2 mol/L pH 6.84磷酸缓冲液充分混合后，取200 μL，加入10 μL 60 μg/mL样品溶液，混匀， 放入酶标仪中，37 ℃恒温孵育1 h，并在470 nm波长处测其吸收值，每隔10 min读数1次。

试验以纯乙醇代替样品溶液作为空白对照组，E0和C0分别表示反应起始(0 min)时样品组和对照组的吸光值，Et和Ct分别代表样品组在任意间隔为10 min时刻的吸光值，计算其抗氧化能力(AA)。

2　结果与分析

2.1不同处理方法对核桃种皮颜色的影响从图1可以明显看出，经过4次酸化乙醇超声处理之后，在烘干之前，核桃种皮颜色基本接近于核桃仁，非常白净，烘干之后颜色也较碱处理之后的浅。核桃多酚在0.9%氢氧化钠溶液中呈深褐色，用碱处理之后，虽然立即用大量的清水处理，仍然会有部分残留，烘干之后由于氧化呈现如图1～4所显示的颜色，而这部分已经褐变氧化的核桃多酚会对后续制备的核桃乳的色泽产生影响。

注：1.核桃原料；2.酸化乙醇超声提取4次后未烘干的核桃仁；3.酸化乙醇超声提取4次烘干后的核桃仁；4.碱液脱皮处理烘干后的核桃仁。　Note:1.Raw material of walnut; 2.Walnut kernels without baking after four times of acidic ethanol ultrasonic extraction; 3.Walnut kernels with baking after four times of acidic ethanol ultrasonic extraction; 4.Walnut kernels with baking after alkali peeling treatment.图1　不同处理方法及阶段的核桃仁颜色Fig.1　Colors of walnut kernels by different treatment methods

2.2不同处理方法对核桃总酚含量的影响由图2可见，核桃多酚在碱性条件下是不稳定的，在酸性和中性条件下非常稳定。碱处理之后的，绝大部分的核桃多酚都已经溶解在碱液中，但是测定出总酚含量只有0.51 mg/g。酸化乙醇提取的多酚含量为14.85 mg/g，提取率为96.6%，远高于碱法提取的，且前者在多酚残留量上也稍微低于后者。

图2　不同处理方式的总酚含量Fig.2　The total phenol contents in different treatments

2.3对DPPH自由基清除能力由于DPPH自由基是一个稳定的自由基，且该分析方法简单快速，自1958年被提出以来[17]，便广泛被国内外用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力[18]。DPPH自由基醇溶液为紫色，在有自由基清除剂存在时，DPPH上的单电子会因为配对而使溶液的颜色渐渐变浅，特征吸收波长为517 nm。

图3　不同浓度的核桃多酚、TBHQ、VC、VE溶液对DPPH自由基的清除效果Fig.3　DPPH radical scavenging ability of walnut polyphenols, TBHQ, VC and VE at different concentrations

由图3可知，清除DPPH自由基能力由强到弱的顺序为核桃多酚>TBHQ≈VC>VE。4种物质清除DPPH自由基的能力均与浓度成正比，酸化乙醇提取的核桃多酚表现出较高的清除自由基的能力。浓度20 μg/mL核桃多酚清除DPPH自由基的能力高于100 μg/mL的VE，与60 μg/mL的TBHQ和VC相当。核桃多酚、TBHQ、VC、VE对DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)分别为59.91、136.60、165.02、223.76 μg/mL。2.4对ABTS自由基清除能力ABTS法是用来测定总抗氧化能力的方法，在氧化剂的作用下，ABTS会被氧化成绿色的ABTS·+，而抗氧化剂与该自由基配对后，溶液颜色变浅，在波长734 nm下的吸光值下降，故可以采用比色法的测定结果来衡量自由基清除情况，从而评价抗氧化剂的抗氧化效果。

由图4可得，清除ABTS自由基能力由强到弱的顺序为核桃多酚>TBHQ≈VC>VE，与DPPH测定的排序结果一致，4种物质清除ABTS自由基的能力与浓度成正比，酸化乙醇提取的核桃多酚仍然表现出最高的清除自由基的能力，不同浓度的VE清除ABTS自由基的能力变化不大。在一定浓度范围内，随着浓度的增加，各个抗氧化剂之间的抗氧化能力差异增大。核桃多酚、TBHQ、VC、VE对ABTS自由基的半抑制浓度(IC50)分别为55.82、87.84、93.77、185.93 μg/mL。

图4　不同浓度的核桃多酚、TBHQ、VC、VE溶液对ABTS自由基的清除效果Fig.4　ABTS radical scavenging ability of walnut polyphenols, TBHQ, VC and VE at different concentrations

2.5对铁离子的还原能力该方法主要是测定抗氧化剂的还原力[19]，还原力强，则电子供应能力强。还原力的高低可间接反映抗氧化能力强弱。

由图5可知，3种样品还原力的变化趋势与代表总抗氧化能力的ABTS指标的变化趋势一致，还原力强弱顺序为核桃多酚>VC>TBHQ。在此体系中，TBHQ的抗氧化能力稍微低于VC，可能是因为反应体系的差异。在铁离子的还原力测定中，以蒸馏水为溶剂，而TBHQ在水中的溶解度较小，随着浓度的增大，TBHQ与VC的差异越来越大。核桃多酚则随着浓度的增大，还原力极速增加，说明核桃多酚在水溶性体系中能表现出更好的抗氧化效果。

图5　不同浓度的核桃多酚、TBHQ、VC溶液的铁还原力结果Fig.5　 Ferric reducing power of walnut polyphenols, TBHQ, and VC at different concentrations

2.6抗油脂过氧化能力β-胡萝卜素漂白测试体系的原理是，在一定温度下，亚油酸自动氧化产生自由基，使得β-胡萝卜素褪色，在波长470 nm下，特征吸收减弱。而抗氧化剂可以清除自由基，从而保护β-胡萝卜素不褪色，起到保护作用。

图6显示，抗氧化活性顺序为TBHQ>VE≈核桃多酚。这与清除DPPH、ABTS自由基不同，核桃多酚表现出了较差的抗氧化活性。说明由于核桃多酚的极性较强[20]，不太适用于抗油脂氧化。随着时间的推移，3种抗氧化剂抗氧化能力在0～20 min内均呈现下降趋势，20～60 min又开始升高，这可以用自由基产生的动力学理论来解释。自由基产生需要经过自由基的引发、增长和终止3个阶段。在引发阶段，自由基数量较少，随后迅速增加，慢慢的趋于平稳后终止，因此抗氧化能力便呈现上述趋势。

图6　60 μg/mL核桃多酚、TBHQ、VE溶液在β-胡萝卜素漂白测试体系下的抗氧化能力Fig.6　Antioxidant activity of 60 μg/ mL walnut polyphenols, TBHQ and VE measured by β-carotene bleaching assay

3　结论

(1)酸化乙醇超声辅助处理核桃仁的方法，不仅可以提取活性较高的核桃多酚，提高核桃仁的附加值，而且处理后的核桃仁多酚残留量更低，颜色更好，可为后续制备核桃乳提供更好的原材料，同时不产生工业废水，有益于环境保护。

(2)从体外抗氧化评价体系可以看出，核桃多酚能够在极性较强的体系中表现出高于TBHQ、VC、VE的抗氧化活性，其抗氧化活性与浓度成正相关。

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Ultrasonic Extraction of Walnut (JuglansregiaL.) Kernel and Analysis of the Oxidation Resistance of the Extracts

LI Xiao-xiao, ZHANG Wen-bin*, YANG Rui-jins

(College of Food,Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] To extract polyphenols fromJuglansregiaL.with realtivley high activity, and to enhance the utilization value ofJ.regia.[Method] Ultrasonic extraction was applied directly to processJ.regiakernel by adding 70% ethanol containing 0.05 mol/L hydrochloric acid.The total phenol content was measured by Folin-Ciocalteu method.The antioxidant activity was evaluated using free radicals scavenging capacity and iron ion reducing ability.[Result] As for the four times ultrasonic extraction (65 ℃, 10 min) ofJ.regiaextracting solution, polyphenols content was (12.03±0.16)mg/g walnut kernel; The remained polyphenols in the kernel was 0.38 mg/g walnut kernel, which was lower than that in walnut kernel treated with conventional alkali soaking method.Compared with t-butyl hydroqumone (TBHQ) and vitamin C, walnut polyphenol extract showed superior antioxidant capacity in terms of scavenging free radicals and reducing iron ion.[Conclusion] Direct ultrasonic extraction of walnut kernel not only removed polyphenols with high efficiency but also provided potential antioxidant additive for food industry.

Walnut kernels; Polyphenols; Antioxidant activity; Ultrasonic extraction

国家自然科学基金项目(31401635)；国家“863”计划研究项目(2013AA102014)。

李笑笑(1989- )，女，河南巩义人，硕士研究生，研究方向：食品加工与配料。*通讯作者，副教授，从事食品加工与配料研究。

2016-04-18

TS 201.1

A

0517-6611(2016)19-090-04