周瑾艳，陈玲，毛沅文，周阳，尹强，许俊斌（广东省计量科学研究院，广州 510405）



罗丹明B纯度标准物质的研制*

周瑾艳，陈玲，毛沅文，周阳，尹强，许俊斌
（广东省计量科学研究院，广州 510405）

以商购罗丹明B为原料，进行重结晶提纯，制备罗丹明B纯度标准物质。采用红外光谱（IR）、高分辨质谱和核磁共振谱（NMR）进行定性分析。样品分装400瓶后，依据国家《一级标准物质研制技术规范》，采用液相色谱-二极管阵列法对随机抽取的15瓶样品进行均匀性检验，经F检验表明，在95%的置信区间范围内，样品均匀性良好。在室温下，经过30个月稳定性考察，结果表明样品稳定性良好。标准物质经国内8家具有分析资质的实验室进行协同定值，定值结果为99.0%，扩展不确定度为1.0%（k=2）。该标准物质达到了国家标准物质的技术要求，可用于有关罗丹明B的分析方法校正和质量控制。

罗丹明B；标准物质；纯度；重结晶；不确定度

目前食品安全问题已成为全社会关注的热点和焦点。许多食品安全问题与食品添加剂的使用不当有关，如超出范围、超量使用或非法使用食品添加剂。食用色素是用来着色的食品添加剂［1-3］。随着食用色素安全性实验技术的发展，有的合成色素有致癌作用，能诱发染色体变异。2003年沸沸扬扬的“苏丹红”风暴引起了全世界对色素安全的关注，2005年质检总局查出不法分子用罗丹明B替代苏丹红制出毒花椒和火锅底料。

罗丹明B（Rhodamine B）又称玫瑰红B，是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料。经老鼠试验发现，罗丹明B会引致皮下组织生肉瘤，被怀疑是致癌物质，国家已经明令禁止在食品中使用。目前行业内大都使用国外进口的罗丹明B标准品，德国Dr. Ehrenstorfer Gmb H和美国Accustandard®分别研制了罗丹明B的纯度标准物质和溶液标准物质。但这些标准物质通常价格昂贵，且采购周期长。我国关于罗丹明B有证标准物质的研制还未见报道。因此基于食品安全的需求和保障国家食品安全溯源体系，笔者研制了罗丹明B有证标准物质，为食品安全检测和监督管理提供重要技术支撑。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695-2998型，美国Waters 公司；

傅里叶红外光谱仪：Tensor-37 型，德国布鲁克公司；

核磁共振仪：DPX-300 型，美国Bruker公司；

高分辨质谱仪：Agilent 6540 Q-TOF 型，美国安捷伦科技公司；

罗丹明B原料：纯度大于95%，市购；

甲醇：色谱级，德国Merck公司；

实验所用其它试剂均为分析纯；

实验用水为超纯水。

1.2罗丹明B标准样品的制备

采用高纯罗丹明B为原料，以甲醇-水（体积比为5∶1）为溶剂，在电热板上加热至80℃使其溶解后，再分次加入适量甲醇和水（甲醇和水的用量比为1∶1），保温20 min，滤过，4℃条件下重结晶5 h，过滤后干燥，经研磨过筛，混匀后得罗丹明B候选标准物质。将纯化后的罗丹明B纯度样品分装于棕色玻璃样品瓶，每瓶200 mg，共分装约400瓶。封装好的样品，放置于4℃冰箱保存。

1.3定性分析

采用红外光谱、核磁H谱和高分辨质谱对罗丹明B标准物质主成分进行定性分析。

1.4定值分析

罗丹明B标准物质纯度采用液相色谱法［4-6］进行测定。

1.4.1仪器工作条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：甲醇；波长：545 nm；流量：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：35℃。

1.4.2样品配制

随机抽取分装好的罗丹明B标准物质，准确称取100 mg，用甲醇稀释至100 mL容量瓶，得到质量浓度为1 mg/mL的样品溶液，用液相色谱法进行纯度检测，每次进样10 μL，每个样品重复进样3次。

2　结果与讨论

2.1定性分析

采用红外光谱、核磁H谱对研制的罗丹明B标准物质主成分进行定性分析。图1、图2分别为研制的罗丹明B纯度标准物质的红外谱图和SDBS图库中罗丹明B标准红外谱图。图3、图4分别为研制的罗丹明B纯度标准物质的核磁H谱图和SDBS图库中罗丹明B的核磁H谱图。由图1、图2可知，纯化后罗丹明B的红外谱图与标准谱图相符，判断主成分为罗丹明B；由图3、图4可知，纯化后罗丹明B核磁共振H谱图与标准H谱图相符，说明该纯度物质与罗丹明B结构一致。

图1　研制的罗丹明B纯度标准物质的红外谱图

图2　SDBS图库中罗丹明B标准红外谱图

图3　罗丹明B纯度标准物质的核磁共振H谱图

图4　SDBS图中的罗丹明B标准核磁H谱图

2.2均匀性检验

标准物质的均匀性是衡量标准物质性能的一项重要指标，也是标准物质量值准确传递的基础。采用方差分析法来统计检验所研制的标准物质的均匀性。参照标准物质技术规范，分别从已经分装好的400瓶罗丹明B纯度样品中按照头尾、中间编号各随机抽取15瓶样品。准确称量抽取的样品约10 mg，配制成溶液，采用液相色谱-面积归一化法测定纯度，每瓶样品平行进样3次，以每次测量的平均值作为均匀性评价结果，然后对其进行方差分析，结果列于表1、表2。

表1　罗丹明B纯度标准物质均匀性检验结果 %

查表得Fα=2.037，经计算F=0.658，F

2.3稳定性检验

依据标准物质技术规范，按照前紧后疏的原则，对罗丹明B纯度标准物质进行了30个月的长期稳定性考察，结果见表3。另外对短期稳定性进行了考察，短期稳定性是指标准物质在运输过程中的稳定性。为了考察运输条件对标准物质稳定性的影响，并综合考虑到南方的高温天气，模拟运输条件，随机抽取6瓶样品，置于运输条件下（60℃±5℃，培养箱中）和常规储存条件下（4℃±1℃），考察其短期稳定性，结果表4。

表3　罗丹明B纯度标准物质长期稳定性试验结果

表4　罗丹明B标准物质短期稳定性试验结果

采用直线模型作为经验模型，对罗丹明B长期稳定性数据进行分析［7］，计算得斜率斜率不显著，即表明在30个月内罗丹明纯度标准物质的量值没有发生明显的趋势性变化。同时对两种条件下的测量数据进行同样的统计分析，发现储存条件和运输条件下罗丹明B标准物质的稳定性均良好。

2.4定值结果与不确定度

2.4.1定值结果

（1）罗丹明B纯度标准物质的原料经重结晶提纯，按照“国家一级标准物质技术规范”的要求，主成分纯度采用8家实验室合作定值，所采用的定值方法为液相色谱面积归一化法［7-11］。8家实验室定值的分析结果见表5。

表5　罗丹明B纯度标准物质定值结果 %

采用狄克逊准则和格拉布斯准则［12-13］对所有数据进行可疑值分析，结果表明未发现可疑值。因此采用8家实验室的总平均值作为联合定值的结果。

采用液相色谱-面积归一化法测定罗丹明B的纯度，其结果不包含标准物质的水分和残渣，因此需要对其水分和残渣进行测试。

（2）水分测试。水分测试采用卡尔费休水分测定仪，重复测量6次，取平均值作为水分测试结果，得到罗丹明B纯度标准物质水分含量为0.17%。

（3）残渣测试。残渣分析通过高温灼烧测得。称取适量样品，在（650±50）℃的马弗炉中灼烧至恒重进行称量，重复测量6次，取平均值得到罗丹明B纯度标准物质残渣含量为0.34%。

（4）定值结果。根据多家实验室液相色谱法定值结果及样品水分和残渣的测定值，罗丹明B的纯度：

2.4.2定值结果的不确定度评定

根据JJG 1006-1994 《一级标准物质技术规范》及标准物质定值的相关规定［4-7］，标准值定值结果的不确定度由3部分组成：罗丹明B定值实验引入的不确定度u定值；样品不均匀引入的不确定度u均；样品不稳定性引入的不确定度u稳。依据实验测量结果，计算出罗丹明B标准物质的特性标准值和不确定度分量，各不确定度分量见表6。

表6　定值不确定度分量评定结果

根据表6，合成不确定度：

取包含因子k=2，则扩展不确定度：

罗丹明B纯度标准物质的定值结果：

3　结论

研制的罗丹明B纯度标准物质经过了均匀性、稳定性考察，采用多家实验室对其进行联合定值，定值结果准确可靠。该标准物质的研制可满足食品、药品、日化、环境保护及化工产品的检测需要，可用于相关仪器（色谱仪）的校准、分析方法评价，为统一相关量值发挥作用。

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［5］ 乔海鸥，胡佳薇，王敏娟.高效液相色谱荧光检测法测定辣椒及花椒制品中的罗丹明B［J］.中国卫生检验杂志，2014，24（5）: 641-644.

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［10］ JJF 1059-2012 测量不确定度评定与表示［S］.

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Development of Rhodamine B Certified Reference Material

Zhou Jinyan， Chen Ling， Mao Yuanwen， Zhou Yang， Yin Qiang， Xu Junbin
（Guangdong Institute of Metrology， Guangzhou 510405， China）

Rhodamine B certified reference material was developed. Raw material was recrystallized for preparation of Rhodamine B by business purchased. The structure of Rhodamine B certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy （IR），high resolution mass spectral and nuclear magnetic resonance （NMR）. The homogeneity testing were evaluated by liquid chromatography with diode array detector detector （LC-DAD）. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 400 bottles，and the results were validated by F-test statistical method. The test results indicated that the homogeneity was good in the 95% confidence interval. The stability inspection was carried at room temperature for 30 months. The results indicated that the stability was good. A cooperative certification was conducted by eight qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of Rhodamine B was 99.0% with relative expaned uncertainty of 1.0%（k=2）. The reference material can meet the technical requirement of the certified reference material， it can be used for the method validation and quality control regarding Rhodamine B.

Rhodamine B； certified reference material； purity； recrystallization； uncertainty

O657

A

1008-6145（2016）04-0004-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.001

*广东省质量技术监督局科技计划项目（2013ZJ02）

联系人：周瑾艳；E-mail: zhoujinyan2005@163.com

2016-05-17