王贻莲，谢雪迎，扈进冬，陈凯，杨合同，李纪顺

(山东省科学院生物研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014)



【农业微生物】

霜霉病高效生防菌株BCJB01发酵培养基的优化

王贻莲，谢雪迎，扈进冬，陈凯，杨合同，李纪顺*

(山东省科学院生物研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014)

摘要：为提高霜霉病高效生防菌株Bacillus cereus BCJB01的发酵水平，通过正交试验、综合优选及糖分流加试验，优化BCJB01的发酵培养基。优化出的培养基配方的质量分数为：玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、四水氯化锰0.003 0%、十二水磷酸氢二钠0.30%、二水磷酸二氢钠0.15%、七水硫酸镁0.035%、氯化钙0.10%和酵母提取物0.30%，接菌后6～12 h流加质量分数0.2%糖。本研究优化的培养基配方在接种量为3%(V/V)，转速为180 r /min，温度为 30 ℃的摇床振荡培养至66 h时，芽孢率近90%，菌体数量达100×108cfu/mL以上。

关键词：蜡样芽孢杆菌；霜霉病；发酵培养基；正交设计；综合优选

霜霉病是作物上普遍发生的一种世界性病害，常见的有瓜类霜霉病和葡萄霜霉病。瓜类霜霉病不仅侵染甜瓜和黄瓜，还对葫芦科的西瓜、南瓜、丝瓜及蛇瓜等12 种瓜类作物造成危害[1]。葡萄霜霉病是葡萄的重要病害，严重影响葡萄生长及果实产量，给葡萄产业造成重大的经济损失[2-3]。

化学防控一直是控制霜霉病的主要措施，多数果蔬产区需要多次、大量施用化学药剂才能成功防控其危害[4]，同时易引起抗药性增强、病害再猖撅及残留加重等问题。瓜果蔬菜是直接食用的，不能用高毒、高残留农药，因此，生物防治成为防控果蔬霜霉病害的首选措施。近年来，利用拮抗微生物被认为是有效控制植物病害的重要途径[5]。多种生防菌，如木霉(Trichodermaspp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、砖红微杆菌(Microbacteriumtestaceum)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)以及苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)[6-11]等对霜霉病有抑制作用。作者在霜霉病害生物防治研究中筛选到1 株可有效防治葡萄和黄瓜霜霉病的生防菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，命名为BCJB01，菌种保存号为CGMCCNO.10477(已申请专利)。为提高霜霉病高效生防菌株BCJB01的发酵水平，本文以玉米粉和豆粕粉为主要原料，通过正交试验对BCJB01菌株的发酵培养基进行了初级优化，将初级优化出的培养基组合添加酵母提取物进行综合优选，并流加糖分，提高生防菌的发酵水平，以期为其工业化生产及推广应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1供试菌株

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus) BCJB01菌株，系本试验室保存菌种，菌种保存号CGMCCNO.10477。

1.2培养基

1.2.1普通培养基

蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，pH =7.2；固体培养基添加0.8%的琼脂，以上均为质量分数。

1.2.2发酵培养基的优化

正交试验：以玉米粉和豆粕粉为主要原料，辅以四水氯化锰、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、七水硫酸镁及氯化钙，共7个因素，分别设置3种不同的水平，进行正交试验条件优化，正交试验采用L18(37)设计(表1)。

培养基综合优化：在正交优选的培养基配方中添加质量分数0.30%酵母提取物，并将其在160、180和200 r /min的转速条件下进行综合比较。

糖分流加试验：以综合优选培养基配方及培养条件为基础，分别测定在接种时及接种后6、12和24 h流加糖不同接种时间对BCJB01菌体数量的影响。

表1　发酵培养基正交试验因素和水平设计(%)

1.3培养方法

将斜面活化的BCJB01菌株接种到50 mL 普通培养基中，30 ℃振荡培养10 h 后，以3%(V/V)的接种量转接到发酵培养基中(空气液体比为10∶1)，160、180和200 r /min，30 ℃摇瓶振荡培养，至48 h或66 h停止培养。

1.4菌体及芽孢测定方法

菌体数量采用血球计数板计数，每处理重复测定3次。芽孢形成率用结晶紫染液染色后于显微镜下观察计数。

2　结果与分析

2.1正交试验

正交试验结果见表2。由表2可知，正交优选配方为A2B1C2D3E2F3G2，即质量分数为玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、二水磷酸二氢钠0.15%、十二水磷酸氢二钠0.30%、氯化钙0.10%、七水硫酸镁0.035%和四水氯化锰0.003 0%。

表2　正交试验实验结果

2.2培养基综合优选

培养基综合优选试验结果见表3。由表3可知，不同转速条件下，添加酵母提取物的P2配方发酵液菌体数量均有提高。其中转速为180 r /min的情况下，P2配方发酵液菌体数量最高，为52.60 ×108cfu/mL，是P1配方的1.52倍。同时，芽孢率为92%。表明添加质量分数0.30%的酵母提取物可有效提高发酵液菌体数量，转速为180 r /min的培养条件有利于BCJB01产生芽孢。

表3　培养基综合优选试验结果

2.3流加糖对BCJB01菌体数量及芽孢形成的影响

以综合优选培养基配方及培养条件为基础，分别测定流加糖不同接种时间对BCJB01菌体数量的影响。流加糖对BCJB01菌体数量的影响结果见表4。由表4可知，在接菌后6～24 h流加糖均能提高BCJB01菌体数量，其中接菌后6 h流加糖菌体数量增加最多，是未流加糖配方的1.95倍。结合芽孢形成率来看，接菌后6～12 h流加糖有利于BCJB01菌体数量的增加，对芽孢的形成与脱落影响不大。

表4　流加糖对BCJB01菌体数量及芽孢脱落的影响

3　讨论

近年来，蜡样芽孢杆菌作为生防菌已有一些研究报道，研究人员发现其对黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、竹白纹羽病(Rosellinianecatrix)、松材线虫病(Bursaphelenchusspp.)、小麦全蚀病(Gaeumannomycesgraminisvar．tritici(Ggt))和纹枯病(Rhizoctoniacerealis)均有抑制作用[12-17]，但用于防治霜霉病的研究还鲜见报道。徐迟默等[18]2015年报道，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)通过分泌抗生素对荔枝霜霉病(Peronophytholitchii)产生抑制。本研究中的蜡样芽孢杆菌BCJB01对霜霉病的抑制机理与其不同，它具有降解霜霉病游动孢子的作用，直接切断了病原菌的有效传染源(未发表资料)。因此，蜡样芽孢杆菌BCJB01具有良好的生防应用价值。

生防菌株的发酵水平是其应用的基础。在实际生产中，芽孢杆菌的发酵培养基配方通常有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其他一些微量元素[19]。本研究发现，发酵培养基的成分及配比，对BCJB01发酵后菌体含量有很大的影响。其中，添加酵母提取物及发酵过程中流加糖均可显著提高BCJB01发酵液的菌体数量，添加酵母提取物是不添加的1.52倍，流加糖是未流加糖的1.95倍。最终筛选出BCJB01的培养基配方的质量分数为：玉米粉2.00%，豆粕粉1.00%，四水氯化锰0.003 0%，十二水磷酸氢二钠0.30%，二水磷酸二氢钠0.15%，七水硫酸镁0.035%，酵母提取物0.30%和氯化钙0.10%，同时在接菌后6～12 h流加0.2%糖，菌体数量达100×108cfu/mL以上。

有效活菌数是衡量微生物菌剂品质的重要指标[20]，芽孢是有效活菌数的重要组成部分，抗逆性强，可耐受多种环境伤害，是制备微生物菌剂的理想形态。霜霉病高效生防菌株BCJB01若要实现产业化生产，发酵培养基的优化既要考虑菌体数量，还要考虑芽孢生成率。本文发现流加糖能提高BCJB01的菌体数量，但却影响它的芽孢形成率，流加糖的时间十分关键，接菌后6～12 h流加糖既有利于BCJB01菌体数量的增加，又对芽孢脱落影响不大，芽孢形成率接近90%。

霜霉病高效生防菌株BCJB01优化后的培养基配方，发酵液菌体数量较优化前有了显著提高，菌体数量达100×108cfu/mL以上。本研究是在实验室摇瓶发酵条件下进行的，若要实现产业化生产，还需在发酵罐条件下进行发酵及后处理工艺参数的优化试验，同时要进行相关剂型的研究开发，后续工作正在进行中。

参考文献：

[1]杨柳燕,徐永阳,徐志红,等. 甜瓜霜霉病研究进展[J].中国瓜菜, 2011, 24(3): 38-43.

[2]李宝燕,王英姿,刘学卿,等.3 种杀菌剂对葡萄霜霉病菌的毒力测定和田间药效试验[J].江苏农业科学,2014,42(1):98-99.[3]李宝燕,王培松,王英姿.葡萄霜霉病的生物药剂防治[J].农药,2014,53(11): 853-855.

[4]秦文韬. 葡萄霜霉病菌快速分子检测方法研究[D].北京：中国农业科学院.2013.

[5]刘婧,马汇泉,董瑾,等.蜡样芽孢杆菌B-02菌株培养基及培养条件的优化[J].山东农业科学,2008(7):54-57.

[6]PERAZZOLLIM, MORETTOM, FONTANA P, et al. Downy mildew resistance induced byTrichodermaharzianumT39 in susceptible grapevines partially mimics transcriptional changes of resistant genotypes [J]. BMC Genomics 2012, 13:660.

[7]岳宪化,胡夫防,段丽峰,等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病试验[J].中国果树,2014(2):54-56.

[8]陈浩,胡梁斌,唐春平,等.枯草芽胞杆菌B-FS01对葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保护,2011,37(6):194-197.

[9]郭继平,马光,朱会霞,等. 葡萄霜霉病拮抗细菌N6的分离、筛选及鉴定[J].湖北农业科学,2014,53(17):4063-4065.

[10]扈进冬,吴远征,李纪顺,等.拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2及其制剂对葡萄霜霉病的防效测定[J].山东科学,2014,27(3):30-33.

[11]臧超群,赵奎华,刘长远,等.生防菌株SY286 对葡萄霜霉病菌的抑菌效果[J].沈阳农业大学学报,2014,45(2): 221-224.[12]朱玥妍,刘姣,杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J].安徽农业科学,2012,40(34):16635-16638.

[13]唐容容,杨文革,胡永红,等.蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及机理研究[J].湖北农业科学,2013,52(8):1817-1820.

[14]朱天辉,李姝江,韩珊,等.杂交竹白纹羽病生防菌的筛选与应用[J].四川林业科技,2013,34(6):8-12.

[15]彭双,闫淑珍,陈双林.具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和活性产物[J].微生物学报,2011,51(3):368-376.

[16]王刚, 刘凤英,王淼,等.内生细菌B3-7的运动性参与其在小麦根系的内生定殖和对小麦全蚀病的生物防治[J].植物病理学报, 2011, 41(5):526-533.

[17]黄秋斌,张颖,刘凤英,等.蜡样芽孢杆菌B3-7在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果[J].生态学报,2014,34(10): 2559-2566.

[18]徐迟默,谢龙莲,曾筱芬,等.荔枝霜霉病生物防治研究进展[J].南方农业学报,2015,46(1):72-78.

[19]张文芝,王云鹏,刘红霞,等.蜡质芽孢杆菌AR156 发酵培养基及发酵条件的优化[J].微生物学通报,2010,37(6):803-810.[20]梁昌聪,郭立佳,刘磊,等.响应面法优化解淀粉芽孢杆菌 C101 发酵培养基[J].生物技术通报,2014 (8) :169-174.

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.007

收稿日期：2016-04-27

基金项目：山东省重点研发计划(2015GNC113002)；山东省科学院-枣庄市产业技术研发联合基金(201503)；公益性行业( 农业) 科研专项(201203035)

作者简介：王贻莲(1978-)，女，副研究员，研究方向为应用微生物。Email：yilianwang@ 163.com *通信作者。 Email：yewu2@sdas.org

中图分类号：Q939.95

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)04-0030-05

Optimization of fermentative medium for highly effective biocontrol strainBacilluscereusBCJB01 against downy mildew

WANG Yi-lian,XIE Xue-ying,HU Jin-dong,CHEN Kai,YANG He-Tong,LI Ji-shun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶To improve fermentation level of Bacillus cereus BCJB01, a highly efficient biocontrol strain against downy mildew, we optimized its fermentative medium through orthogonal test, comprehensive optimization and sugar feeding tests. Mass fraction of the optimized medium formula are 2.00% corn meal,1.00% soybean powder, 0.0030% manganese chloride tetrahydrate, 0.30% twelve aqueous disodium hydrogen phosphate, 0.15% sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, 0.10% calcium chloride, 0.30% yeast extract, 0.2%sugar added at 6～12 h after inoculation. It can produce more than 100×108 cfu/mL cells and its spore rate is 90%, when the cultivation conditions are 3%(V/V) inoculum size, 180 r / min rotation velocity, 30 ℃ shaky cultivation till 66 hours.

Key words∶Bacillus cereus;downy mildew;fermentative medium;orthogonal design; comprehensive optimization