黄义玲, 高雪峰

(吉林大学生命科学学院, 长春 130012)



L-缬氨酸对精氨酸酶Ⅰ抑制作用的分子动力学模拟

黄义玲, 高雪峰

(吉林大学生命科学学院, 长春 130012)

摘要利用分子动力学模拟与酶学实验相结合的方法, 研究了L-缬氨酸(L-Val)对野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ的酶促反应动力学的影响. 精氨酸酶Ⅰ的活性口袋附近有一个较大的空穴C2, 分子动力学模拟结果显示, 突变Ile156Arg缩小了空穴C2的容积, 而实验结果表明, L-Val对突变型精氨酸酶Ⅰ抑制剂的半抑制浓度(IC50)由3.06 mmol/L升高到6.26 mmol/L, 增加了1倍, 因此精氨酸酶Ⅰ可能存在一个位于空穴C2的调节位点, 并且L-Val可以结合于此干扰精氨酸酶Ⅰ的活性.

关键词精氨酸酶Ⅰ; 分子动力学模拟; 突变; 半抑制浓度; 调节位点; L-缬氨酸

精氨酸酶(Arginase,EC3.5.3.1)是一种含锰的金属酶, 以2种同工酶形式存在于人和哺乳动物的不同组织器官中, 通过锰活化羟基机制催化L型精氨酸发生水解反应, 生成尿素和鸟氨酸, 这一反应在体内的代谢过程中起到了关键作用[1]. 精氨酸酶Ⅰ(ArginaseⅠ)主要的表达位置是肝脏, 其催化精氨酸发生水解作用, 使精氨酸转变为尿素, 然后通过尿液排出体外[2～5]. 精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ)是一种线粒体酶, 主要存在于脑、 肾和骨骼肌等组织中, 它不影响尿素循环, 其主要功能是控制精氨酸的含量从而使细胞内的鸟氨酸达到一种平衡状态, 调控体内一氧化氮、 脯氨酸和多胺等物质的合成过程[6～9]. 对于细胞的增殖和分化过程, 多胺是一种不可缺少的物质, 它在上述过程中起到非常重要的作用[10,11]. 脯氨酸的主要作用是促进胶原蛋白分泌以及加快伤口愈合[12,13]. 当生物体缺乏精氨酸酶时, 可能导致一些精氨酸酶缺陷症的发生, 如身体发育迟缓及神经系统缺陷等[14～16]. 因此, 对精氨酸酶的相关性研究一直备受关注, 并将其当作疾病治疗的靶标酶, 研究不同物质对其活性的影响, 使得精氨酸酶在新药开发方面备受重视[8,9].

通常认为L-缬氨酸(L-Val)对精氨酸酶起抑制作用, 其抑制作用的类型是竞争性抑制, 同时也有研究指出L-Val与精氨酸酶不是以摩尔比1∶1结合, 即可能存在其它结合位点[17]. 本文通过计算机模拟和酶学实验研究相结合的方法, 研究了精氨酸酶Ⅰ的结构特征, 以及野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ的酶促反应动力学, 发现精氨酸酶Ⅰ表面可能存在一个调节位点, 而且L-Val可能结合于此位点抑制酶的活性. 为以精氨酸酶为靶点的药物设计、 开发、 改造等提供新思路.

1分子动力学模拟

Fig.1　Three-dimensional structure of ArginaseⅠ The secondary structure of ArginaseⅠis shown by ribbon model, His141 is shown by tube model, Mn2+ is shown by two balls, the α-helix is H1-helix between C1 and C2.

在精氨酸酶Ⅰ表面有2个大空穴(即C1和C2), 2个空穴通过一段α螺旋H1相连, 二者的相对位置如图1所示.C1为活性口袋, 是2个Mn2+和催化关键氨基酸His141所在的空穴, 容积约6.6×10-3nm3,C2与C1相邻, 是酶表面的另一个空穴, 由一段Loop环围绕而成, 容积约3.74×10-3nm3. L-Val的分子比较小, 所以L-Val有可能结合在除了活性口袋C1以外的空穴C2内. 为了缩小C2的容积, 降低L-Val的结合机率, 根据C2的空间结构特点和氨基酸分布, 将异亮氨酸(Ile)156突变为精氢酸(Arg), 随后进行分子动力学模拟, 观察突变后精氨酸酶Ⅰ的空穴C1及C2的空间结构, 特别是空穴C2的容积变化. 采用人源精氨酸酶Ⅰ的X射线衍射结构(PDB编号: 2ABE), 删除其结晶水, 加氢, 然后优化. 通过spdbv程序将野生型精氨酸酶Ⅰ的结构空穴C2内的Ile156突变为Arg, 突变后的结构先固定除了Arg156以外的氨基酸残基, 对Arg156进行能量优化和800K的模拟退火. 对突变型精氨酸酶Ⅰ和野生型精氨酸酶Ⅰ同时进行模拟, 即无约束的50ns分子动力学模拟. 运用GROMACS4.5程序, 在ffG43a2力场下进行, 使用的模型为spc216水模型[18～22],Mn2+离子的参数用Zn2+离子参数替代. 首先, 对酶进行能量优化, 然后固定复合物对水分子进行1ns的分子动力学模拟, 使复合物充分“浸泡”在溶剂中, 然后对酶进行50ns的分子动力学模拟, 静电相互作用采用PME理论, 非键相互作用的cut-off值为0.9,rcoulomb值为1.2, 步长为2fs, 每200步(0.4ps)保存一个构象, 压力耦合采用semiisotropic方式, 耦合常数为0.1ps, 设定复合物分子和水的耦合温度均为300K, 耦合常数为0.1ps[23].

2实验部分

2.1仪器与试剂

酶标仪MultiskanFC(Thermoscientific). L-Arg和L-Val(Sigma公司); 人源精氨酸酶Ⅰ质粒由清华大学生命科学院提供.

2.2实验原理

精氨酸酶催化 L-Arg水解为L-鸟氨酸和尿素(Scheme1), 尿素与邻苯二甲醛(oPA)和N-(1-萘基)乙烯-二胺盐酸盐(NED)形成特有的红色复合物, 颜色的深浅与尿素浓度成正比, 因此可以通过测定反应体系的尿素浓度来获取酶的动力学信息. 反应体系在37 ℃反应2h, 加入冷的终止显色液(1.6mmol/LoPA, 0.8mmol/LNED), 室温静置显色20min, 立即于520nm处测定吸光度[23,24].

Scheme 1　Catalytic reaction by Arginase Ⅰ

2.3酶促反应动力学参数测定

酶的活力单位定义为在一定的酶和底物浓度下, 每分钟水解精氨酸的微摩尔数, 其与反应速率成正比, 故酶的活性大小可用一定的酶和底物浓度下的反应速率来表征. 分别表达并纯化了突变型及野生型精氨酸酶Ⅰ, 测定L-Val对2种酶的活性影响. 缓冲体系pH=7.4, 野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ的浓度均为0.06U/mL, 底物L-Arg浓度为25mmol/L, 测定不同L-Val浓度下的酶促反应速率.

3结果与讨论

3.1野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ的分子动力学模拟

Fig.2　RMSD curve(A) and amino acid RMSD(B) of W-ArginaseⅠand R-ArginaseⅠ

Fig.3　Structure of W-Arginase Ⅰ and R-Arginase Ⅰ The secondary structure of W-ArginaseⅠ and R-Arginase Ⅰ is shown by ribbon model, the 156I of W-Arginase Ⅰ is shown by tube model, the 156R of R-Arginase Ⅰ is shown by ball-stick model.

Fig.4　Relationship between the initial reactionrate and the concentration of L-Vala. W-Arginase Ⅰ; b. R-Arginase Ⅰ.

经过50ns的分子动力学模拟, 野生型(W)和突变型(R)精氨酸酶Ⅰ的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线见图2(A). 野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ均在30ns后达到平衡状态, 二者RMSD值在0.15～0.17nm之间. 结合图2(B)可知, 点突变对精氨酸酶Ⅰ的整体结构没有影响. 野生型(W)和突变型(R)精氨酸酶Ⅰ的重叠结构展示在图3中. 分子动力学模拟平衡后二者的三维结构几乎重合, 图3中球棒模型展示的156R侧链伸展到空穴的内部, 使得突变型(R)精氨酸酶Ⅰ的C2空穴容积明显缩小, 由野生型的3.74×10-3nm3缩小到1.4×10-3nm3, 降低了L-Val结合在空穴C2的机率.

3.2L-Val对野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响

通过测定不同浓度L-Val存在时酶催化反应的初始速率, 可以得到L-Val对野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ活力的影响, 结果见图4. L-Val对野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ的酶促反应都具有抑制作用, 并且这种抑制作用随着L-Val浓度的增加而逐渐增强. 当L-Val浓度小于0.6mmol/L时, L-Val对野生型和突变型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度差别不大, 而当L-Val浓度大于0.6mmol/L时, L-Val对野生型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度明显大于对突变型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度, L-Val浓度为4mmol/L时, 野生型精氨酸酶Ⅰ的活力下降约60%, 而突变型精氨酸酶Ⅰ的活力只下降约35%, L-Val对野生型精氨酸酶Ⅰ的半抑制浓度(IC50)为3.06mmol/L, 而对突变型精氨酸酶Ⅰ的IC50为6.26mmol/L.

在L-Val低浓度(<0.6mmol/L)时, L-Val对野生型和突变型精氨酸酶的C2空穴的结合率都很低, L-Val只能与底物竞争结合在活性口袋C1, 这时L-Val与酶接近以摩尔比1∶1结合. 在此浓度范围内, L-Val对野生型和突变型精氨酸酶的抑制程度一致.

随着L-Val浓度的上升, L-Val对野生型精氨酸酶Ⅰ的C2空穴的结合率升高, L-Val可以同时结合在活性口袋C1和空穴C2, 协同抑制酶的活性, L-Val与酶逐渐接近以摩尔比2∶1结合. 而对于突变型精氨酸酶Ⅰ而言, 因为突变导致突变型精氨酸酶Ⅰ的空穴C2容积明显缩小, 削弱了L-Val与C2位点的亲和力, 并且L-Val与C2位点的结合率未随着L-Val浓度的上升而升高, 或升高程度不及野生型精氨酸酶Ⅰ, L-Val只能(或主要)与底物竞争结合在活性口袋C1, 无法实现双L-Val分子协同抑制酶的活性作用, 因此L-Val对野生型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度明显大于对突变型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度. 另外, 空穴C2是图1中Loop围成的区域, 并通过α螺旋H1与空穴C1(即活性口袋)相联, 而组氨酸(His)141是精氨酸酶催化机制的关键氨基酸, 它位于空穴C1内, 并且在α螺旋H1的末端. 如果L-Val结合在C2位点, L-Val则可能通过干扰H1的结构, 改变His141侧链咪唑基在活性中心的空间位置, 进而影响酶的催化反应, 使酶活下降. 实验结果表明, L-Val对精氨酸酶Ⅰ催化精氨酸水解反应具有明显的抑制作用, 并且对野生型精氨酸酶Ⅰ的抑制程度明显大于对突变型精氨酸酶Ⅰ的抑制程度, 而分子动力学模拟显示空穴C2内的点突变对酶整体构象特别是活性口袋的构象没有明显干扰, 仅缩小了空穴C2的体积, 降低了L-Val在空穴C2的结合率, 因此可以推断精氨酸酶Ⅰ可能存在一个位于空穴C2的调节位点, 而且L-Val可以结合于此位点, 协同抑制酶的活性.

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(Ed.:Y,Z)

doi:10.7503/cjcu20160007

收稿日期:2016-01-05. 网络出版日期: 2016-04-15.

中图分类号O641

文献标志码A

MolecularDynamicsSimulationoftheInhibitionAgainstArginaseΙCatalyzedReactionbyL-Val

HUANGYiling,GAOXuefeng*

(College of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, China)

AbstractMolecular dynamics simulation and mutation were used to get the influence at activity and kinetics of enzyme catalyzed reaction by L-Val on W-Arginase Ι and R-Arginase Ι. There is a big cavity C2 near the activity pocket of Arginase Ι. The result of molecular dynamics simulation shows that the mutation of Ile156Arg narrows the cavity volume of C2. The experimental result shows that influenced by L-Val the half maximal inhibitory concentration(IC50) of R-Arginase Ι has been risen obviously, the IC50by 3.06 mmol/L rises to 6.26 mmol/L. Therefore, Arginase Ι does exist a regulatory site in C2 and L-Val can combine on this site to disturb the activity of Arginase Ι.

KeywordsArginase Ι; Molecular dynamics simulation; Mutation; Half maximal inhibitory concentration(IC50); Regulatory site; L-Val

联系人简介: 高雪峰, 男, 博士, 副教授, 主要从事生物大分子体系的计算模拟研究.E-mail:gaoxf@jlu.edu.cn